劉志雄, 王小龍, 薛 鑫, 李福衛(wèi), 于海濤

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥物合成技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023)

·研究論文·

新型吡咯并三嗪酮類PARP-1抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及生物活性

劉志雄, 王小龍, 薛 鑫, 李福衛(wèi), 于海濤*

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥物合成技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023)

分別以5-溴-2-氟苯甲腈(1a)和3-溴苯甲腈(1b)為原料，經(jīng)Sonogashira偶聯(lián)，脫三甲基硅基保護(hù)基，三分子偶聯(lián)及水解等5步反應(yīng)制得中間體2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氫吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]苯甲酸(6a)和3-[(4-氧代-3,4-二氫吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]苯甲酸(6b)。環(huán)烷基甲酸經(jīng)酰氯化，縮合和脫Boc保護(hù)基3步反應(yīng)制得環(huán)烷基哌嗪-1-基甲酮(7a～7c)。 6a與NCS(1 eq.)反應(yīng)制得5-[(6-氯-4氧代-3,4二氫吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]-2氟-苯甲酸(6c); 6a與NCS(2 eq.)反應(yīng)制得5-[(6,7-二氯-4氧代-3,4二氫吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]-2氟-苯甲酸(6d)。 6a～6d, 6a～6c分別與7a～7c和1-(2-嘧啶基)哌嗪在TBTU(縮合劑)，DIPEA(堿)的作用下合成了13個(gè)新型吡咯并三嗪酮類PARP-1抑制劑(8a～8m)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS(ESI)表征。采用Alarm blue法研究了8a～8m對(duì)腫瘤細(xì)胞MDA-MB-436的抑制活性(IC50)。結(jié)果表明：8f, 8g, 8i和8j對(duì)MDA-MB-436有較強(qiáng)的抑制活性(IC50=30.5～69.3 nmol·L-1)。

苯甲腈; 吡咯并三嗪酮; PARP-1抑制劑; 合成; 生物活性

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是一種家族酶，它們催化ADP核糖單元從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(DAD+)轉(zhuǎn)移至各種蛋白底物上。該家族酶包括17個(gè)成員，其中PARP-1研究最為廣泛。PARP-1的主要功能為作為DNA修復(fù)因子，其效果在堿基切除修復(fù)過程中尤為顯著[1-6]。

Chart 1

2014年12月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了全球首種PARP-1抑制劑——奧拉帕尼(Olaparib)，用于治療BRCA基因突變的卵巢癌患者。研究表明，PARP-1的C端催化區(qū)的天然底物為NAD+，根據(jù)催化區(qū)域位置和功能的不同，可以分為3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[7]：煙酰胺-核糖結(jié)合位點(diǎn)(NI site)、磷酸結(jié)合位點(diǎn)(PH site)和腺苷-核糖結(jié)合位點(diǎn)(AD site)。現(xiàn)有的PARP-1抑制劑大多通過與NAD+競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PARP-1的NI site而產(chǎn)生活性[8]。NAD+與NI site的結(jié)合模式為：(1)吡啶環(huán)與PARP-1蛋白的Tyr896和Tyr907產(chǎn)生π-π堆積作用。(2)甲酰胺基團(tuán)與PARP-1蛋白的Gly863和Ser904形成3個(gè)氫鍵(Chart 1)[9]。

本文通過分析Olaparib的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和NAD+與PARP-1的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)并合成了未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的新型吡咯并三嗪酮類PARP-1抑制劑(8a～8m)并研究了其生物活性。(1)將苯環(huán)改變成吡咯環(huán)，增加芳香環(huán)的富電性，考察對(duì)這種π-π堆積作用力的影響。減小A環(huán)的空間體積，使抑制劑繼續(xù)深入PARP-1的V字形口袋，考察該改變對(duì)抑制劑與PARP-1蛋白的氫鍵結(jié)合力的影響。(2)保留哌嗪環(huán)為堿性末端以調(diào)節(jié)水溶性，并以PARP-1抑制劑結(jié)構(gòu)中常見的環(huán)丙基羰基、2-嘧啶基及環(huán)戊基羰基連接哌嗪環(huán)(Chart 2)。

Chart 2

以5-溴-2-氟苯甲腈(1a)和3-溴苯甲腈(1b)為原料，經(jīng)Sonogashira偶聯(lián)，脫三甲基硅基保護(hù)基，三分子偶聯(lián)及水解等5步反應(yīng)制得中間體2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氫吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]苯甲酸(6a)和3-[(4-氧代-3,4-二氫吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]苯甲酸(6b)。環(huán)烷基甲酸經(jīng)酰氯化，縮合和脫Boc保護(hù)基3步反應(yīng)制得環(huán)烷基哌嗪-1-基甲酮(7a～7c)。 6a與NCS(1 eq.)反應(yīng)制得5-[(6-氯-4氧代-3,4二氫吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]-2氟-苯甲酸(6c); 6a與NCS(2 eq.)反應(yīng)制得5-[(6,7-二氯-4氧代-3,4二氫吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]-2氟-苯甲酸(6d)。 6a～6d, 6a～6c分別與7a～7c和1-(2-嘧啶基)哌嗪在TBTU(縮合劑)，DIPEA(堿)的作用下合成了13個(gè)新型吡咯并三嗪酮類PARP-1抑制劑(8a～8m)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS(ESI)表征。采用Alarm blue法研究了8a～8m對(duì)腫瘤細(xì)胞MDA-MB-436的抑制活性(IC50)。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-5型顯微熔點(diǎn)儀；Bruker Ascend 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent 1100型液質(zhì)聯(lián)用儀；Bio-Tek Synergy HT型多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀;Invitrogen C10281 Countess型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器。

人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-436)，美國模式菌種收集中心；Alarm Blue試劑，Sigma公司；其余所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1) 2a和2b的合成(以2a為例)

在反應(yīng)瓶中依次加入1a 12.0 g(60.00 mmol),碘化亞銅0.576 g(3.0 mmol), PdCl2(PPh3)22.1 g(2.9 mmol),三乙胺25.2 mL(181.5 mmol)，三甲基硅乙炔8.52 mL(60.28 mmol)和THF 200 mL,氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌下回流(60 ℃)反應(yīng)18 h(TLC監(jiān)測(cè))。冷卻至室溫，加入飽和氯化銨水溶液400 mL,分液，水相用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，用飽和NaCl溶液(300 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(EA) ∶V(PE)=1 ∶20]純化得棕色油狀液體2-氟-5-三甲基硅烷乙炔基苯甲腈(2a)9.96 g,產(chǎn)率76.6%。

用類似的方法合成棕色油狀液體3-(三甲基硅基乙炔基)苯甲腈2b，收率80%[10]。

(2) 3a與3b的合成(以3a為例)

在反應(yīng)瓶中依次加入四正丁基氟化銨35.9 g(137.30 mmol)和THF 200 mL，于室溫緩慢滴加至2a 9.96 g(45.83 mmol)的THF(400 mL)溶液中，反應(yīng)完全(TLC監(jiān)測(cè))。加入飽和氯化銨水溶液400 mL，分液，水相用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，用飽和NaCl溶液(300 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[A=V(EA) ∶V(PE)=3 ∶1]純化得黃色固體5-乙炔基-2-氟苯甲腈(3a)5.86 g，產(chǎn)率88.1%。

用類似的方法合成黃色固體3b,產(chǎn)率83.0%[10]。

(3) 4a和4b的合成(以4a為例)

在反應(yīng)瓶中依次加入對(duì)甲苯磺酰疊氮6.0 g(30.42 mmol)，氯化亞銅0.3 g(3.04 mmol), 4a 5.3 g(36.51 mmol)和氯仿60 mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)，于室溫?cái)嚢?0 min；依次加入三乙胺5.10 mL(36.51 mmol)和吡咯6.30 mL(91.27 mmol),于45 ℃反應(yīng)4 h(TLC監(jiān)測(cè))。加入飽和氯化銨水溶液100 mL，分液，水相用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)相，用飽和NaCl溶液(300 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干得灰色固體N-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-1-(1H-吡咯-2-基)亞乙基]-4-甲基苯磺酰胺(4a)7.95 g，產(chǎn)率68.5%; MS(ESI)m/z: 382.1{[M+H]+}。

用類似的方法合成灰色固體4b,產(chǎn)率70.0%; MS(ESI)m/z:364.1{[M+H]+}[11]。

(4) 5a和5b的合成(以5a為例)

在反應(yīng)瓶中依次加入4a 7.0 g(18.35 mmol)，肼基甲酸乙酯2.8 g(26.89 mmol)和叔丁醇50 mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)，于室溫?cái)嚢?0 min;加入叔丁醇鉀6.0 g(53.47 mmol),回流(80 ℃)反應(yīng)12 h(TLC監(jiān)測(cè))。冷卻至室溫，加入水100 mL，用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)至pH≈7，用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，用飽和NaCl溶液(300 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=1 ∶10)純化得黃色粉末2-氟-5-(4-氧代-3,4-二氫吡咯并[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基-甲基)苯甲腈(5a)4.21 g，產(chǎn)率86.3%;1H NMRδ: 12.18(s, 1H), 7.93(dd,J=6.2 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.81～7.70(m, 2H), 7.46(t,J=9.1 Hz, 1H), 6.93(dd,J=3.7 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.83～6.76(m, 1H), 4.15(s, 2H); MS(ESI)m/z: 269.0{[M+H]+}。

用類似的方法合成黃色粉末5b,產(chǎn)率79.6%;1H NMRδ: 12.19(s, 1H), 7.86(s, 1H), 7.72(dd,J=17.0 Hz, 4.7 Hz, 1H), 7.52(t,J=7.8 Hz, 1H), 6.93(d,J=3.4 Hz, 1H), 6.80(t,J=3.3 Hz, 1H), 4.17(s, 2H); MS(ESI)m/z: 251.1{[M+H]+}。

(6) 6a與6b的合成(以6a為例)

在反應(yīng)瓶中依次加入5a 1.8 g(6.71 mmol)，氫氧化鈉1.4 g(35.00 mmol)和水30 mL，于室溫?cái)嚢?0 min，回流(90 ℃)反應(yīng)8 h(TLC監(jiān)測(cè))。冷卻至室溫。滴加1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)至pH酸性，析出白色固體，過濾，濾餅用混合溶液(A=1 ∶5)洗滌，真空干燥得白色固體6a 1.8 g,產(chǎn)率93.3%;1H NMRδ: 13.20(s, 1H), 11.84(s, 1H), 7.79(dd,J=7.1 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.62～7.48(m, 1H), 7.37～6.99(m, 3H), 6.31～6.13(m, 1H), 4.14 (s, 2H); MS(ESI)m/z: 288.0{[M+H]+}。

用類似的方法合成白色固體6b;1H NMRδ: 13.10(s, 1H), 11.74(s, 1H), 7.75(s, 1H), 7.54～7.24(m, 4H), 6.91(s, 1H), 6.80(s, 1H), 4.14(s, 1H); MS(ESI)m/z: 270.0{[M+H]+}。

(7) 6c和6d的合成(以6c為例)

將NCS 0.496 g(3.71 mmol, 1 eq.)溶于二氯甲烷30 mL中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于-5 ℃依次加入四氯化鋯86.6 mg(0.371 mmol)和6a 1.0 g(3.71 mmol)，加畢，緩慢升至室溫，反應(yīng)完全(TCL監(jiān)測(cè))。加水50 mL，析出固體，過濾，濾餅用混合溶液(A=1 ∶5)洗滌，真空干燥得淡黃色固體6c 0.89 g，產(chǎn)率80.0%;1H NMRδ: 12.04(s, 1H), 7.69(dd,J=7.0 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.44～7.36(m, 1H), 7.06(dd,J=10.4 Hz, 8.5 Hz, 1H), 6.83(d,J=4.0 Hz, 1H), 6.72(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.00(s, 2H); MS(ESI)m/z: 322.0{[M+H]+}。

僅改變NCS為2 eq.，用類似的方法合成黃色固體6d, 產(chǎn)率86%;1H NMRδ: 12.20(s, 1H), 7.75(dd,J=7.1 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.55～7.48(m, 1H), 7.24(dd,J=10.7 Hz, 8.6 Hz, 1H), 6.99(s, 1H), 4.25(s, 2H); MS(ESI)m/z: 356.0{[M+H]+}[12]。

(8) 7a～7c的合成(以7c為例)

將環(huán)戊酸1.0 g(8.76 mmol)溶于氯化亞砜(10 mL)中，回流2 h。旋干氯化亞砜，殘余物用二氯甲烷10 mL溶解；緩慢滴加N-Boc哌嗪1.7 g(9.13 mmol)的二氯甲烷(10 mL)溶液，滴畢，攪拌下于室溫反應(yīng)2 h。旋干二氯甲烷，殘余物真空干燥得白色固體4-環(huán)戊基基甲?；哙?1-甲酸叔丁酯2.3 g，產(chǎn)率93%。

將4-環(huán)戊基-甲?；哙?1-甲酸叔丁酯2.3 g(8.14 mmol)溶于無水甲醇(20 mL)中，劇烈攪拌下通入干燥HCl氣體(1 h);析出大量白色固體，停止通氣，于室溫反應(yīng)1 h。旋干反應(yīng)液，殘余物加入碳酸鈉溶液20 mL，用二氯甲烷(3×30 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用大量飽和碳酸鈉溶液和氯化鈉飽和溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，旋干，殘余物真空干燥得無色油狀液體環(huán)戊基-哌嗪-1-基甲酮(7c)1.41 g，產(chǎn)率95%;1H NMRδ: 3.57(t,J=4.0 Hz, 2H), 3.47(t,J=4.0 Hz, 2H), 2.84～2.87(m, 5H), 2.21(s, 1H), 1.65～1.77(m, 6H), 1.48～1.58(m, 2H); MS(ESI)m/z: 183.1{[M+H]+}。

用類似的方法合成無色油狀液體環(huán)丁基-哌嗪-1-基甲酮(7b), 產(chǎn)率91%;1H NMRδ: 3.48～3.16(m, 6H), 2.70～2.55(m, 5H), 2.22～1.63(m, 5H); MS(ESI)m/z: 169.1{[M+H]+}。

無色油狀液體環(huán)丙基-哌嗪-1-基甲酮(7a)，產(chǎn)率92%;1H NMRδ: 3.65(t,J=4.0 Hz, 2H), 3.44(t,J=6.0 Hz, 2H), 3.32(m, 3H), 3.29(m, 2H), 1.97(s, 1H), 0.73(dt,J=9.5 Hz, 5.3 Hz, 4H); MS(ESI)m/z: 155.1{[M+H]+}。

(9) 8a～8m的合成(以8b為例)

在反應(yīng)瓶中依次加入6b 2.0 g(7.43 mmol), 7c 1.4 g(7.68 mmol)，苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)3.6 g(11.21 mmol),N,N-二異丙基乙胺2.9 g(22.44 mmol)和DMF 20 mL，攪拌下于室溫反應(yīng)3 h。加入水100 mL，用1 mol·L-1鹽酸調(diào)至pH=7，析出大量固體，繼續(xù)滴加鹽酸至無固體析出。過濾，濾餅依次用大量水和少量乙醇洗滌，真空干燥得白色固體1-[3-(4-環(huán)戊基羰基-1-哌嗪-1-甲酰基)芐基]-3H-吡咯并[1,2-d][1,2,4]三嗪-4-酮(8b)3.0 g，產(chǎn)率93.0%[13]。

用類似的方法合成白色固體8a, 8c～8m。

8a: 產(chǎn)率91.0%, m.p.131.2～134.3 ℃;1H NMRδ: 7.29(d,J=7.3 Hz, 1H), 6.91(s, 1H), 6.80(s, 1H), 4.14(s, 2H), 3.90～3.00(m, 8H), 0.84(m, 1H), 0.75～0.72(m, 4H); MS(ESI)m/z: 406.1{[M+H]+}。

8b: 產(chǎn)率92.1%, m.p.142.2～145.4 ℃;1H NMRδ: 12.21(s, 1H), 7.75(d,J=7.6 Hz,1H), 7.45～7.37(m, 3H), 7.27(d,J=7.4 Hz,1H), 6.91(d,J=2.6 Hz, 1H), 6.80(t,J=3.2 Hz, 1H), 4.13(s, 2H), 3.54～3.27(m, 8H), 1.65～1.53(m, 8H), 0.88～0.82(m, 1H); MS(ESI)m/z: 434.2{[M+H]+}。

8c: 產(chǎn)率92.1%, m.p.126.1～131.0 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H), 7.74(d,J=1.5 Hz, 1H), 7.42～7.58(m, 2H), 7.25(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.91(d,J=2.8 Hz, 1H), 6.80(d,J=2.9 Hz, 1H), 4.13(s, 2H), 3.19～3.76(m, 8H), 1.99～2.04(m, 1H), 0.72～0.75(m, 4H); MS(ESI)m/z: 424.1{[M+H]+}。

8d: 產(chǎn)率93.2%, m.p.139.1～142.2 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H), 7.75(d,J=1.6 Hz, 1H), 7.43(dd,J=32.8 Hz, 13.2 Hz, 2H), 7.25(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.91(d,J=2.6 Hz, 1H), 6.8(s, 1H), 4.11(s, 2H), 3.54～3.27(m, 8H), 1.65～1.53(m, 8H), 0.88～0.82(m, 1H); MS(ESI)m/z: 452.2{[M+H]+}。

8e: 產(chǎn)率92.1%, m.p.109.5～114.8 ℃;1H NMRδ: 12.06(s, 1H), 7.46(ddd,J=12.5 Hz, 7.6 Hz, 5.2 Hz, 1H), 7.41(d,J=5.4 Hz, 1H), 7.25(s, 1H), 6.90(d,J=4.0 Hz, 1H), 6.80(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.06(s, 2H), 3.82～3.09(m, 8H), 1.33～0.61(m,5H); MS(ESI)m/z: 458.1{[M+H]+}。

8f: 產(chǎn)率93.2%, m.p.115.1～117.4 ℃;1H NMRδ: 12.06(s, 1H), 7.46(dd,J=7.1 Hz, 4.5 Hz, 1H), 7.39(d,J=6.3 Hz, 1H), 7.24(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.89(t,J=3.9 Hz, 1H), 6.79(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.05(s, 2H), 3.63～3.10(m, 8H), 2.23～1.58(m, 7H); MS(ESI)m/z: 472.1{[M+H]+}。

8g: 產(chǎn)率93.6%, m.p.116.6～119.4 ℃;1H NMRδ: 12.06(s, 1H), 7.47(s, 1H), 7.40(d,J=5.8 Hz, 1H), 7.24(t,J=8.9 Hz, 1H), 6.89(s, 1H), 6.79(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.05(s, 2H), 3.55～3.18(m, 8H), 1.84～1.24(m, 9H); MS(ESI)m/z: 486.1{[M+H]+}。

8h: 產(chǎn)率92.1%, m.p.119.2～121.4 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H), 7.39(d,J=5.9 Hz, 1H), 7.33～7.29(m, 1H), 7.24(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.98(s, 1H), 4.23(s, 2H), 3.84～3.12(m, 8H), 0.95～0.61 (m, 5H); MS(ESI)m/z: 492.1{[M+H]+}。

8i: 產(chǎn)率94.2%, m.p.123.1～125.3 ℃;1H NMRδ: 12.22(s, 1H), 7.37(s, 1H), 7.29(d,J=6.4 Hz, 1H), 7.23(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.99(s, 1H), 4.22(s, 2H), 3.65～3.06(m, 8H), 2.22～1.61(m, 7H); MS(ESI)m/z: 506.1{[M+H]+}。

8j: 產(chǎn)率91.3%, m.p.126.1～129.3 ℃;1H NMRδ: 12.23(s, 1H), 7.38(s, 1H), 7.30(dd,J= 6.4 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.24(t,J=8.0 Hz, 1H), 6.99(s, 1H), 4.23(s, 2H), 3.68～2.84(m, 8H), 1.82～1.12(m, 9H); MS(ESI)m/z: 520.1{[M+H]+}。

8k: 產(chǎn)率91.4%, m.p.198.5～220.3 ℃;1H NMRδ: 12.21(s, 1H), 8.39(d,J=4.7 Hz, 2H), 7.75(dd,J=2.8 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.48～7.38(m, 3H), 7.30(d,J=7.5 Hz, 1H), 6.92(dd,J=3.7 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.80(t,J=3.0 Hz, 1H), 6.68(t,J=4.7 Hz, 1H), 4.14(s, 2H), 3.82～3.27(m, 8H); MS(ESI)m/z: 416.2{[M+H]+}。

8l: 產(chǎn)率93.1%, m.p.220.2～223.1 ℃;1H NMRδ: 9.44(s, 1H), 8.35(d,J=4.7 Hz, 2H), 7.77(d,J=1.6 Hz, 1H), 7.40～7.28(m, 2H), 7.08(t,J=8.7 Hz, 1H), 6.73(t,J=3.3 Hz,1H), 6.57(t,J=4.7 Hz, 1H), 6.66(d,J=2.7 Hz, 1H), 4.08(s, 2H), 3.84～3.40(m, 8H); MS(ESI)m/z: 434.2{[M+H]+}。

8m: 產(chǎn)率94.1%, m.p.225～228.4 ℃;1H NMRδ: 12.06(s, 1H), 8.39(d,J=4.7 Hz, 2H), 7.50～7.45(m, 1H), 7.42(dd,J=6.5 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.25(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.91(d,J=4.1 Hz, 1H), 6.79(d,J=4.0 Hz, 1H), 6.68(t,J=4.7 Hz, 1H), 4.06(s, 2H), 3.87～3.79(m, 2H), 3.75～3.65(m, 4H), 3.31～3.24 (m, 2H); MS(ESI)m/z: 468.1{[M+H]+}。

1.3 抗腫瘤活性測(cè)試

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-436解凍后，置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，在37 ℃, 5%CO2條件下培養(yǎng)。鋪板前，應(yīng)使細(xì)胞傳兩代以上。

(2) 受試化合物配制

以DMSO為空白溶媒，AZD2281為陽性對(duì)照。分別稱取適量AZD2281和受試化合物，加入適量DMSO，渦旋振蕩使其完全溶解，分裝后放入冰箱(-80 ℃)保存。

(3) IC50的測(cè)定

檢查每板細(xì)胞密度，保證細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。細(xì)胞懸液離心5 min(2 000～3 000 r·min-1)，取上清液，用少量新配培養(yǎng)液潤洗，沉淀，合并上清液，稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL。使用12-通道移液槍將細(xì)胞懸液按100 mL/孔加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，余下每孔各加PBS 200 μL。將96孔板置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。每孔加入含系列濃度受試化合物的完全培養(yǎng)液或?qū)φ盏耐耆囵B(yǎng)液100 μL。將板置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。去除每孔中的培養(yǎng)液，每孔加入含有相應(yīng)藥物的新鮮培養(yǎng)液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。將1 mmol·L-1Alarm blue溶液22 μL加至96孔板各孔中后，培養(yǎng)7 h。振蕩10 s，測(cè)試波長530 nm和590 nm處各孔的熒光強(qiáng)度，計(jì)算IC50[14-17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

合成5c和5d的關(guān)鍵是控制5a與NCS的當(dāng)量比，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)5a與NCS的當(dāng)量比為1 ∶1，反應(yīng)溫度控制在0 ℃以下，反應(yīng)時(shí)間控制在0.5 h內(nèi)時(shí)，大部分產(chǎn)物為一氯代物5c，極少量產(chǎn)物為二氯代物5d，產(chǎn)率約80%。當(dāng)5a與NCS的當(dāng)量比為1 ∶2，反應(yīng)溫度控制在0 ℃以下，反應(yīng)時(shí)間控制在0.5 h內(nèi)時(shí)，大部分產(chǎn)物為二氯代物5d，少部分產(chǎn)物為一氯代物和三氯代物，產(chǎn)率約86%。

2.2 生物活性和初步構(gòu)效關(guān)系

表1為目標(biāo)化合物對(duì)MDA-MB-436腫瘤細(xì)胞的抑制活性。

表1 8a～8m對(duì)MDA-MB-436的抑制活性Table 1 Inhibition activities of 8a～8m against MDA-MB-436

從表1可以看出，8f, 8g, 8i, 8j的抑制活性較好(IC50<100 nmol·L-1)，但均比對(duì)照藥Olaparib差。這說明增加芳香環(huán)的富電性不能增強(qiáng)π-π堆積作用力。8a與8c, 8b與8d活性相當(dāng)，說明結(jié)構(gòu)中引入F不能顯著增強(qiáng)抑制劑活性，這可能是因?yàn)镠和F體積接近所致。8e和8h的抑制活性明顯優(yōu)于8c, 8j和8g明顯優(yōu)于8d, 8m優(yōu)于8l，說明增大A環(huán)的體積可以提高化合物活性，其可能原因?yàn)椋涵h(huán)體積增大使抑制劑與PARP-1蛋白結(jié)合更緊密，增大了相互之間的氫鍵作用力。8f與8g活性明顯優(yōu)于8e, 8i與8j活性明顯優(yōu)于8h，說明末端取代優(yōu)先選擇體積較大的基團(tuán)，這可能是因?yàn)榇蠡鶊F(tuán)有助于增強(qiáng)抑制劑與PARP-1蛋白之間的氫鍵作用力。

以5-溴-2-氟苯甲腈(3-溴苯甲腈)為原料,合成了13個(gè)新型的吡咯并三嗪酮類PARP-1抑制劑(8a～8m)。采用Alarm blue法研究了8a～8m對(duì)MDA-MB-436腫瘤細(xì)胞的抑制活性。結(jié)果表明：8f, 8g, 8i和8j的抑制活性較好(IC50<100 nmol·L-1)。初步構(gòu)效關(guān)系表明：(1)增加芳香環(huán)富電性不能增加抑制活性；(2)結(jié)構(gòu)中引入氟原子不能顯著增加化合物活性；(3)吡咯環(huán)上有一氯取代和二氯取代的化合物活性明顯優(yōu)于無取代物；(4)末端取代時(shí)，環(huán)丁基與環(huán)戊基取代化合物活性明顯優(yōu)于環(huán)丙基。

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Design, Synthesis and Biological Activities of Novel PARP-1 Inhibitors with Pyrazolotriazinone Skeleton

LIU Zhi-xiong, WANG Xiao-long, XUE Xin, LI Fu-wei, YU Hai-tao*

(Research Center of Pharmaceutical Synthesis Technology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

The intermediates, 2-fluoro-5-[(4-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-d][1,2,4]triazin-1-yl)methyl]benzoic acid(6a) and 3-[(4-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-d][1,2,4]triazin-1-yl)methyl]benzoic acid(6b) were obtained by a five-step reaction of Sonogashira coupling, deprotection, triplet coupling, hydrolysis, etc, using 5-bromo-2-fluorobenzonitrile(1a) and 3-bromobenzonitrile(1b) as the materials, respectively. Cycloalkylpiperazin-1-ylmethanone(7a～7c) were prepared by a three-step reaction of chlorination, condensation and deprotection from cycloalkylcarboxylic acid. 5-(6-Chloro-4-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-d][1,2,4] triazin-1-yl)-2-fluoro-benzoic acid(6c) and 5-[(6,7-dichloro-4-oxo-3,4-dihydropyrrolo [1,2-d][1,2,4]-yl) methyl]-2-fluoro-benzoic acid(6d) were obtained by the reaction of 6a with NCS(1 eq. or 2 eq.). Thirteen novel PARP-1 inhibitors(8a～8m) with pyrazolotriazinone skeleton were synthesized by the condensation reaction of 6a～6d, 6a～6c with 7a～7c or 1-(2-pyrimidyl) piperazine, using TBTU as condensation agent and DIPEA as base. The structures were characterized by1H NMR and MS(ESI). The inhibition activities(IC50) of 8a～8m against tumor cells MDA-MB-436 were investigated by the Alarm blue method. The results indicated that 8f, 8g, 8i and 8j exhibited well activities with IC50of 30.5～69.3 nmol·L-1.

benzonitrile; pyrazolotriazinone; PARP-1 inhibitor; synthesis; biological activity

2016-11-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302650); 江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

劉志雄(1991-)，男，漢族，江西吉安人，碩士研究生，主要從事藥物合成的研究。 E-mail: m15195758151@163.com

于海濤,博士，講師， E-mail: njubilly@njucm.edu.cn

O626; O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.02.16280