劉與進(jìn)， 范 恒， 劉星星

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022

綜 述

炎癥性腸病與干細(xì)胞源性微囊泡的研究進(jìn)展*

劉與進(jìn)， 范 恒△， 劉星星

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022

炎癥性腸??； 潰瘍性結(jié)腸炎； 克羅恩?。?干細(xì)胞； 微囊泡； 外泌體

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不完全清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative disease，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。目前研究認(rèn)為，IBD與腸道免疫紊亂及腸道上皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的腸道黏膜屏障破壞有著密切關(guān)系。干細(xì)胞源微囊泡是源于干細(xì)胞的膜性小體，具有免疫調(diào)節(jié)以及抑制凋亡、促進(jìn)組織損傷修復(fù)等作用。本文就干細(xì)胞源微囊泡對(duì)IBD的免疫調(diào)節(jié)及抑制腸道上皮細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展作一綜述。

1 炎癥性腸病

IBD是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，其臨床表現(xiàn)以慢性腹痛、腹瀉以及容易反復(fù)的黏液膿血便為主[1]。該病多發(fā)生于青少年，歐美國(guó)家發(fā)病率較高。但隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人民生活方式的改變，潰瘍性結(jié)腸炎在我國(guó)的發(fā)病率也不斷增加[2]。

IBD的病因尚不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，IBD是多因素綜合作用導(dǎo)致的。有報(bào)道指出超過(guò)160個(gè)基因位點(diǎn)與IBD相關(guān)[3]。腸道菌群失調(diào)以及腸道免疫異常也在IBD發(fā)病中具有重要作用和地位。

IBD目前的藥物治療包括氨基水楊酸、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、生物制劑及靶向藥物，出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥(竇道、腸梗阻)時(shí)需要外科手術(shù)治療，而且需要患者調(diào)整生活方式。近年來(lái)，許多研究表明干細(xì)胞移植在IBD的治療中有著巨大的潛力。干細(xì)胞移植可調(diào)節(jié)IBD患者腸道免疫，修復(fù)腸道組織炎癥損傷，重建腸道血管，進(jìn)而有助于減輕患者腸道炎癥。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植所發(fā)揮的作用主要在于其旁分泌，而微囊泡是其旁分泌的主要物質(zhì)之一。

2 干細(xì)胞源性微囊泡可能是治療IBD的新途徑

2.1 干細(xì)胞及微囊泡

干細(xì)胞(stem cell)是具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始未分化細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cells，HSCs)、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)等。

微囊泡是由Wolf[4]在1967年首次報(bào)道，他發(fā)現(xiàn)的微囊泡來(lái)源于激活的血小板。微囊泡主要存在于循環(huán)系統(tǒng)中，主要來(lái)源于血小板[5]，少部分來(lái)自于其他血液細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞[6]。有多種類型的細(xì)胞可以分泌微囊泡，例如干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等。

根據(jù)微囊泡細(xì)胞內(nèi)的來(lái)源及分泌機(jī)制的不同，可以將其分成細(xì)胞微粒(microvesicles，microparticles)和外泌體(exosome)。微囊泡表面攜帶有其來(lái)源細(xì)胞的表面粘附分子，而靶細(xì)胞正是通過(guò)特異性配體受體相互作用的方式來(lái)捕獲特定的囊泡。其主要通過(guò)3種方式來(lái)影響靶細(xì)胞的生物學(xué)行為：①微囊泡可以通過(guò)特異性配體受體的相互作用直接激活靶細(xì)胞。例如，血小板源微囊泡表面的組織因子可以與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及血小板表面的分子如P-選擇素等相互作用，停留在這些細(xì)胞表面，并且為凝血因子的聚集提供膜表面。此外，血小板源囊泡可以直接激活內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞并且能影響正常或癌變的造血細(xì)胞的功能。②微囊泡通過(guò)在細(xì)胞之間傳遞受體而發(fā)揮作用。例如，血小板源微囊泡可以將血小板表面的粘附分子CD41轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞[7]，進(jìn)而改變內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特征。微囊泡將腫瘤細(xì)胞上的Fas配體轉(zhuǎn)移到活化的T淋巴細(xì)胞，可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡[8]。③微囊泡可以將蛋白或多種RNA傳遞給靶細(xì)胞，進(jìn)而影響靶細(xì)胞的生物學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素激活的單核細(xì)胞可以通過(guò)微囊泡將Caspase-1轉(zhuǎn)移至血管平滑肌細(xì)胞中，為平滑肌細(xì)胞的凋亡提供死亡信號(hào)[9]。此外，腫瘤源微囊泡可以將癌基因翻譯的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到周圍臨近的細(xì)胞中[10]。腫瘤源微囊泡還可以將腫瘤細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)移至單核細(xì)胞[11]。

2.2 干細(xì)胞源性微囊泡或可替代干細(xì)胞移植治療IBD

MSCs是來(lái)源于多種組織的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，其不僅可以分化形成各種組織細(xì)胞，而且具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力。MSCs可通過(guò)減少IFN-γ和TNF-α、增加IL-10的分泌來(lái)抑制T細(xì)胞增殖[12]；也可以通過(guò)活化吲哚胺2，3-二加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)降解色氨酸且抑制T細(xì)胞增殖，而且可以通過(guò)活化IDO和誘生型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)進(jìn)而抑制T細(xì)胞的功能[13]。MSCs與T細(xì)胞(Th1、Th2)共培養(yǎng)時(shí)可促進(jìn)T細(xì)胞向分泌抗炎因子類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)的比例[14]；且可以通過(guò)抑制活化的T細(xì)胞進(jìn)入S期、誘導(dǎo)G0/G1靜止而抑制活化的T細(xì)胞分裂[15]。MSCs可以分泌前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)抑制NK細(xì)胞的增殖及其細(xì)胞毒性[14]，通過(guò)減少IL-1、CD40和TNF-α的分泌以及分泌PEG2抑制單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)的成熟[16]。MSCs還可以抑制單核細(xì)胞分化為成熟的DC[17]，通過(guò)下調(diào)IFN-γ影響NK細(xì)胞的功能[14]。由此可見(jiàn)，MSCs對(duì)獲得性免疫和固有免疫都有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)能力。

國(guó)內(nèi)外許多研究都表明MSCs對(duì)緩解IBD病情有著良好的效果。Lazebnik等[18]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植治療后，潰瘍性結(jié)腸炎患者自身免疫反應(yīng)及腸道損傷黏膜的修復(fù)相較于標(biāo)準(zhǔn)治療有著顯著的提高，提示MSCs移植治療潰瘍性結(jié)腸炎可能成為一種新的治療方式。Garcia-Olmo等[19]的一項(xiàng)臨床一期試驗(yàn)也表明MSCs局部注射在治療并發(fā)瘺管的克羅恩病上有較好的效果。

然而多項(xiàng)研究表明，在MSCs移植治療中，MSCs定植到損傷組織處的數(shù)量以及分化為損傷組織處細(xì)胞的數(shù)量有限[20-21]。MSCs移植的治療效果并不依賴于其定植到相應(yīng)組織中的數(shù)目[22]。這表明MSCs移植的治療效果可能與其旁分泌的各種因子有著密切的聯(lián)系[23]。微囊泡是MSCs旁分泌產(chǎn)生的膜性小體。Bruno等[24]研究發(fā)現(xiàn)MSCs分泌的直徑在80 nm～1 μm的微囊泡能保護(hù)并修復(fù)急性腎小管損傷。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究致力于探究MSCs源性微囊泡對(duì)各種疾病的治療作用。

實(shí)驗(yàn)表明，在培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)時(shí)，加入BM-MSCs源性的外泌體可抑制其產(chǎn)生INF-γ[25]。BM-MSC源性外泌體含有與免疫相關(guān)的miRNA，包括miR301a、miR-Let-7a和miR22。miR301a為NF-κB通路關(guān)鍵分子，與炎癥反應(yīng)和腫瘤遷移密切相關(guān)。體內(nèi)外研究均證實(shí)微囊泡可有效轉(zhuǎn)移特定的mRNAs和miRNAs，且mRNA可以在受體細(xì)胞內(nèi)翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)[26]。干細(xì)胞源外泌體還可通過(guò)上調(diào)受體細(xì)胞抗凋亡基因(Bcl2L1、Bcl2和BIRC8)，下調(diào)細(xì)胞凋亡基因(CASP1、CASP8和LTA)表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管再生，進(jìn)而促進(jìn)組織修復(fù)[27]?？傊琈SCs源性微囊泡也具有調(diào)節(jié)免疫、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)組織修復(fù)等功能，因此其可能替代干細(xì)胞移植成為IBD治療的新途徑。

3 干細(xì)胞源性微囊泡可調(diào)節(jié)IBD腸道免疫

腸道固有免疫和獲得性免疫缺失或者應(yīng)答異常在IBD的發(fā)病中起著關(guān)鍵的作用，各國(guó)學(xué)者在腸道免疫方面對(duì)IBD進(jìn)行了深入而廣泛的研究。多項(xiàng)研究[28-29]發(fā)現(xiàn)，IBD患者存在腸黏膜固有免疫的異常與缺失。腸黏膜內(nèi)免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞)對(duì)腸道致病菌的異常免疫反應(yīng)為IBD的重要特征[30-31]。其中腸道抗炎因子(IL-10、TGF-β等)與炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF等)的平衡失調(diào)及Treg細(xì)胞數(shù)量和功能明顯不足是IBD發(fā)病的重要機(jī)制。MSCs源性微囊泡可降低實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠組織中IL-1β，增加IL-10含量[32-33]，且可以增加共培養(yǎng)免疫細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例。

3.1 IL-1β和IL-10

IL-1β是一個(gè)由固有免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞)或非免疫細(xì)胞(如上皮細(xì)胞)分泌的多效炎癥細(xì)胞因子。經(jīng)炎性體活化的Caspase-1可以酶切Pro-IL-1β形成具有活性的IL-1β。分泌到細(xì)胞外的IL-1β可以與細(xì)胞表面的IL-1R1結(jié)合形成IL-1R復(fù)合體。該復(fù)合體胞內(nèi)部分可募集MyD88進(jìn)而磷酸化一些激酶(IRAK)。通過(guò)一系列磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)促使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活炎癥相關(guān)基因。有研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸黏膜固有層內(nèi)的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及腸道上皮細(xì)胞分泌IL-1β有所增加[34-35]。腸黏膜內(nèi)高水平的IL-1β與IBD患者疾病活動(dòng)度密切相關(guān)[36]。此外，在IBD動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)了高水平的IL-1β與腸炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[37]，并且運(yùn)用IL-1阻滯劑可以改善IBD的嚴(yán)重程度[38-39]。由此可見(jiàn)，IL-1β在IBD的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。

IL-10是由免疫細(xì)胞(Th2、Th1、Treg及TH17等)分泌的多效抗炎細(xì)胞因子。其主要作用于抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)和淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞因子的平衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)；IL-10可與IL-10受體結(jié)合促進(jìn)Foxp3+T淋巴細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制產(chǎn)IL-17的TH17的活化和增殖；有些活化的TH17細(xì)胞分泌的IL-10可以抑制TH17的致病效應(yīng)；IL-10可有效地抑制IL-1、IL-6、IL-12和TNF等促炎因子的產(chǎn)生。因?yàn)镮L-10具有強(qiáng)力的抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)作用，所以其作用的缺失與IBD的發(fā)生有著重要的關(guān)系。全基因組相關(guān)性研究(genome-wide association studies，GWASs)揭示了IL-10和IL-10R等位基因的變異與IBD有著緊密的聯(lián)系，尤其與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系特別密切。有研究發(fā)現(xiàn)由于基因突變引起IL-10和IL-10R功能缺失與早發(fā)性IBD患兒的發(fā)病有著密切的聯(lián)系[40]。甚至有研究人員用IL-10基因缺陷小鼠來(lái)做結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｓ纱丝梢?jiàn)，IL-10在IBD的發(fā)病過(guò)程中有著重要的作用。

MSCs源性微囊泡可以通過(guò)降低炎癥組織中IL-1β水平，增加IL-10的含量來(lái)調(diào)節(jié)炎癥因子與抗炎因子的平衡。有實(shí)驗(yàn)將MSCs源微囊泡靜脈注入TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)，ELISA檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中的IL-1β含量較對(duì)照組明顯降低，而組織中的IL-10較對(duì)照組明顯升高[33]。同樣的，F(xiàn)attore等[32]將MSCs源性微囊泡靜脈注射入DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)，通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織中的IL-1β較對(duì)照組明顯降低。由此可以說(shuō)明，MSCs微囊泡可以調(diào)節(jié)炎癥因子與抗炎因子的平衡而在IBD的治療中有著巨大的潛能。

3.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

Treg是CD4+T細(xì)胞的亞群，在抑制機(jī)體免疫反應(yīng)方面有著重要的作用。根據(jù)Treg分化發(fā)育的途徑不同，可以將其分成天然型Treg(natural Treg，nTreg)和誘導(dǎo)Treg(induced Treg，iTreg)。nTreg是在胸腺中由部分未成熟CD4+T細(xì)胞經(jīng)過(guò)活化后表達(dá)CD25發(fā)育而來(lái)的，iTreg則是由機(jī)體外周初始T細(xì)胞(naive T cell)在特異性抗原刺激下被激活分化，并在IL-2及TGF-β1作用下上調(diào)叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box P3，F(xiàn)oxp3)基因表達(dá)形成，iTreg又可分為T(mén)r1、Th3、CD8+CD28+T細(xì)胞等。Treg細(xì)胞表面有多種高表達(dá)的特異性分子，如Foxp3、CTLA-4、GITR、CD45RO等。其中Foxp3是Treg細(xì)胞特異性標(biāo)志性分子，也是Treg發(fā)育和完善功能主要的調(diào)節(jié)分子[41]。

Treg是獲得性免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在抑制炎癥反應(yīng)及維持免疫平衡方面有著重要的作用。它主要通過(guò)分泌可溶性細(xì)胞因子及直接作用于其他免疫細(xì)胞這兩種方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抑制炎癥反應(yīng)的作用?；罨腡reg可分泌大量的IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子[42-43]，其中IL-10是重要的抗炎因子，TGF-β則可以通過(guò)調(diào)節(jié)Foxp3的表達(dá)來(lái)影響Treg的發(fā)育和功能。Treg表面的CTLA-4/CD28與APC表面的B7結(jié)合產(chǎn)生共刺激信號(hào)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，與DC表面的B7相結(jié)合可以抑制其成熟，進(jìn)而產(chǎn)生特異性免疫耐受[44]。CTLA-4與B7的結(jié)合可以減少Th1的生成，誘導(dǎo)Th1/Th2分化偏移，進(jìn)而促進(jìn)IL-10等抗炎細(xì)胞因子的分泌。Treg還以介導(dǎo)致炎性CD4+T細(xì)胞凋亡來(lái)抑制炎癥反應(yīng)。

Treg細(xì)胞具有抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫的作用，使得它在抑制腸道免疫，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)上有著重要的地位。Treg細(xì)胞數(shù)量的減少或功能異常均可能導(dǎo)致IBD的發(fā)生。IL-2或IL-2Ra基因缺陷小鼠增加了患腸炎的可能，人類基因組研究也報(bào)道IL-2基因是IBD的可疑相關(guān)基因[45]。研究發(fā)現(xiàn)IL-2相關(guān)信號(hào)通路對(duì)維持成熟Foxp3+Treg細(xì)胞的存活是必須的，IL-2或IL-2Ra基因缺陷的小鼠外周組織中成熟Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少[46]。由此推測(cè)Treg細(xì)胞數(shù)量的減少與IBD的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。來(lái)源于CTLA-4或LAG-3基因缺陷小鼠的Treg細(xì)胞在體外試驗(yàn)中不能有效地抑制活化的T細(xì)胞增殖，而且在體內(nèi)試驗(yàn)中不能改善T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性腸炎[47-48]。此外，實(shí)驗(yàn)表明Treg在治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中也有明顯效果，且體內(nèi)增殖的iTreg比nTreg的治療效果好[49]。

有研究發(fā)現(xiàn)脂肪來(lái)源的MSCs的外泌體能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞的數(shù)量及功能[50]。進(jìn)一步的研究將干細(xì)胞源微囊泡與PBMC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增殖[51]。而且有研究人員將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體與CD3/CD28單抗刺激的正常人BPMC相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可在體外明顯抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖，且可以明顯誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例的升高[52]。楊翔宇等[53]發(fā)現(xiàn)，炎性微環(huán)境中的IFN-γ可刺激臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體分泌量明顯增加，且IFN-γ可增強(qiáng)外泌體的免疫調(diào)節(jié)活性，促進(jìn)外泌體升高BPMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例。由此可說(shuō)明，干細(xì)胞源微囊泡可能在調(diào)節(jié)Treg，特別是炎性微環(huán)境中的Treg細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及功能等方面有一定的作用，進(jìn)而在IBD的治療中有著巨大潛力。

4 干細(xì)胞源性微囊泡可減輕IBD腸道上皮細(xì)胞凋亡

腸道上皮細(xì)胞在腸道消化與營(yíng)養(yǎng)吸收中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)它也形成一道屏障并且具有固有免疫的作用，在保護(hù)機(jī)體抵抗外來(lái)病原物質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用。為了保持腸道屏障的完整性，腸道上皮細(xì)胞在不斷地更新。腸道上皮細(xì)胞的增殖與凋亡的失衡可以導(dǎo)致炎癥或者腫瘤等多種疾病發(fā)生。IBD患者腸道可發(fā)現(xiàn)大量上皮細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自IBD患者結(jié)腸組織的細(xì)胞凋亡率高于健康患者結(jié)腸組織，且潰瘍性結(jié)腸炎患者和克羅恩病患者結(jié)腸組織的細(xì)胞凋亡率沒(méi)有差別[54]。蛋白質(zhì)組分析顯示IBD患者病變腸道上皮細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡蛋白8含量是對(duì)照組的7.4倍[55]。Rosen等[56]研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎與結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)STAT6磷酸化增加密切相關(guān)，STAT6抑制劑可減少IL-13誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和腸道屏障的破壞。由此可知，上皮細(xì)胞凋亡的增加是IBD的重要特征，且在IBD的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用。

干細(xì)胞源微囊泡可通過(guò)抑制上皮細(xì)胞凋亡而減輕IBD病變。有研究發(fā)現(xiàn)MSC源性外泌體含有人乳脂肪球EGF因子蛋白(milk fat globule-EGF factor 8 protein，MFGE8)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)等857種蛋白質(zhì)，其中具有全部7afa亞基和7β亞基20S蛋白酶體可降解損傷細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊的蛋白從而抑制損傷細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)與增殖[57]。TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜中c-Caspase-3、c-Caspase-8、c-Caspase-9含量較空白對(duì)照組顯著增加，尾靜脈注射入干細(xì)胞源微囊泡后，c-Caspase-3、c-Caspase-8、c-Caspase-9含量均降低，且注射入微囊泡的濃度越高，其降低的就越顯著[33]。Caspase的活性是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。其在外源性細(xì)胞凋亡和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑都有著重要的地位。由此表明，干細(xì)胞源微囊泡可抑制實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡。

5 MSCs移植治療的局限性及微囊泡治療IBD的優(yōu)勢(shì)及前景

MSCs因其免疫抑制及抑制組織損傷的作用，在用于IBD等自身免疫性疾病的治療上得到了重視。但是進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植治療在效用性和安全性上也存在著不可忽視的問(wèn)題。在效用性方面，由于臨床研究中MSC的劑量國(guó)際上大多采用1.4×106個(gè)/kg治療移植物抗宿主病[58]，但是隨著MSCs的培養(yǎng)傳代，其免疫調(diào)節(jié)等功能逐漸喪失[59]，因此獲得大劑量有效的MSCs仍是一個(gè)有待解決的問(wèn)題。而且靜脈注射MSCs治療時(shí)，其歸巢的比例很少，大部分滯留在肝臟和肺臟中，這就使得MSCs的效用大大降低。在安全性方面，病變組織的微環(huán)境對(duì)MSCs的影響尚不清楚，有研究指出MSCs在病變組織影響下極化成為促炎細(xì)胞[60]或者腫瘤細(xì)胞[61]。且有研究發(fā)現(xiàn)，移植的MSCs可轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤表型進(jìn)而直接或間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織的血管生成[62]?？傊?，MSCs移植治療在效用性及安全性上都存在著局限性。

干細(xì)胞源微囊泡與干細(xì)胞有著調(diào)節(jié)免疫、抑制組織損傷等相似的作用，但沒(méi)有干細(xì)胞所具有的增殖分化等細(xì)胞學(xué)特性，其生物學(xué)特征較為穩(wěn)定。此外,外泌體表面有CD55和CD59，可避免激活調(diào)理素、補(bǔ)體或凝血因子，因此可以在體液中穩(wěn)定存在[63]。外泌體還可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，且可以和多種細(xì)胞相互作用，不易被滅活，是很好的藥物載體[64]。Alvarez-Erviti等[65]首次應(yīng)用修飾后的小鼠外泌體將外源性siRNA傳遞到靶細(xì)胞，成功使小鼠腦組織特定基因沉默。因?yàn)楦杉?xì)胞源微囊泡有這些優(yōu)點(diǎn)，所以其在治療IBD上值得期待。

雖然目前關(guān)于干細(xì)胞源微囊泡的研究多集中于其對(duì)組織損傷的修復(fù)作用，國(guó)內(nèi)外關(guān)于干細(xì)胞源微囊泡在治療IBD方面的研究也很少，但是隨著其免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制的進(jìn)一步揭示，其在IBD的治療上定會(huì)有很廣闊的前景。

[1] Marquez L，Shen C，Cleynen I，et al.Effects of haptoglobin polymorphisms and deficiency on susceptibility to inflammatory bowel disease and on severity of murine colitis[J].Gut，2012，61(4)：528-534.

[2] Wang Y，Ouyang Q.Ulcerative colitis in China：Retrospective analysis of 3100 hospitalized patients[J].J Gastroenterol Hepatol，2007，22(9)：1450-1455.

[3] Knights D，Lassen K G，Xavier R J.Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis：linking host genetics and the microbiome[J].Gut，2013，62(10)：1505-1510.

[4] Wolf P.The nature and significance of platelet products in human plasma[J].Br J Haematol，1967，13(3)：269-288.

[5] George J N，Thoi L L，McManus L M，et al.Isolation of human platelet membrane microparticles from plasma and serum[J].Blood，1982，60(4)：834-840.

[6] Martinez M C.Shed membrane microparticles from circulating and vascular cells in regulating vascular function[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288(3)：H1004-H1009.

[7] Barry O P，Praticò D，Savani R C，et al.Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles[J].J Clin Invest，1998，102(1)：136-144.

[8] Kim J W，Wieckowski E，Taylor D D，et al.Fas ligand-positive membranous vesicles isolated from sera of patients with oral cancer induce apoptosis of activated T lymphocytes[J].Clin Cancer Res，2005，11(2)：1010-1020.

[9] Sarkar A，Mitra S，Mehta S，et al.Monocyte derived microvesicles deliver a cell death message via encapsulated caspase-1[J].PLoS One，2009，4(9)：e7140.

[10] Al-Nedawi K，Meehan B，Micallef J，et al.Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells[J].Nat Cell Biol，2008，10(5)：619-624.

[11] Baj-Krzyworzeka M，Szatanek R，W?glarczyk K，et al.Tum-our-derived microvesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes[J].Cancer Immunol Immunother，2006，55(7)：808-818.

[12] Caplan A I.Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine[J].J Cell Physiol，2007，213(2)：341-347.

[13] Ren G，Su J，Zhang L，et al.Species variation in the mechanisms of mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression[J].Stem Cells，2009，27(8)：1954-1962.

[14] Aggarwal S，Pittenger M F.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J].Blood，2005，105(4)：1815-1822.

[15] Glennie S.Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells[J].Blood，2005，105(7)：2821-2827.

[16] Kronsteiner B，Peterbauer-Scherb A，Grillari-Voglauer R，et al.Human mesenchymal stem cells and renal tubular epithelial cells differentially influence monocyte-derived dendritic cell differentiation and maturation[J].Cell Immunol，2011，267(1)：30-38.

[17] Nauta A J，Kruisselbrink A B，Lurvink E，et al.Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells[J].J Immunol，2006，177(4)：2080-2087.

[18] Lazebnik L B，Kniazev O V，Konopliannikov A G，et al.Allogeneic mesenchymal stromal cells in patients with ulcerative colitis：two years of observation[J].Eksp Klin Gastroenterol，2010，(11)：3-15.

[19] García-Olmo D，García-Arranz M，Herreros D，et al.A phase Ⅰclinical trial of the treatment of Crohn’s fistula by adipose mesenchymal stem cell transplantation[J].Dis Colon Rectum，2005，48(7)：1416-1423.

[20] Ferrand J，Noel D，Lehours P，et al.Human bone marrow-derived stem cells acquire epithelial characteristics through fusion with gastrointestinal epithelial cells[J].PLoS One，2011，6(5)：e19569.

[21] Spees J L，Olson S D，Ylostalo J，et al.Differentiation，cell fusion，and nuclear fusion duringexvivorepair of epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(5)：2397-2402.

[22] Iso Y，Spees J L，Serrano C，et al.Multipotent human stromal cells improve cardiac function after myocardial infarction in mice without long-term engraftment[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，354(3)：700-706.

[23] Caplan A I，Dennis J E.Mesenchymal stem cells as trophic mediators[J].J Cell Biochem，2006，98(5)：1076-1084.

[24] Bruno S，Grange C，Deregibus M C，et al.Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury[J].J Am Soc Nephrol，2009,20(5)：1053-1067.

[25] 馮影，盧士紅，王昕，等.人骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌外泌體特性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2014，22(3):595-599.

[26] Collino F，Deregibus M C，Bruno S，et al.Microvesicles derived from adult human bone marrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected pattern of miRNAs[J].PLoS One，2010，5(7)：e11803.

[27] Camussi G，Deregibus M C，Cantaluppi V.Role of stem-cell-derived microvesicles in the paracrine action of stem cells[J].Biochem Soc Trans，2013，41(1)：283-287.

[28] Marks D J.Defective innate immunity in inflammatory bowel disease：a Crohn’s disease exclusivity?[J].Curr Opin Gastroenterol，2011，27(4)：328-334.

[29] Casanova J，Abel L.Revisiting Crohn’s disease as a primary immunodeficiency of macrophages[J].J Exp Med，2009，206(9)：1839-1843.

[30] Ordas I，Eckmann L，Talamini M，et al.Ulcerative colitis[J].Lancet，2012，380(9853)：1606-1619.

[31] Baumgart D C，Samdborn W J.Crohn’s disease[J].Lancet，2012，380(9853)：1590-1605.

[32] Del Fattore A，Luciano R，F(xiàn)ierabracci A，et al.Microvesicles derived from mensenchymal stem cells show anti-inflammatory activity in an animal model of ulcerative colitis[C].5th meeting of the Forum of Italian Researchers on mesenchymal and stromal stem cells，2013.

[33] Yang J，Liu X，F(xiàn)an H，et al.Extracellular vesicles derived from bone marrow mesenchymal stem cells protect against experimental colitis via attenuating colon inflammation，oxidative stress and apoptosis[J].PLoS One，2015，10(10)：e140551.

[34] Mahida Y R，Wu K，Jewell D P.Enhanced production of interleukin 1-by mononuclear cells isolated from mucosa with active ulcerative colitis of Crohn’s disease[J].Gut，1989，30(6)：835-838.

[35] Mcalindon M E，Hawkey C J，Mahida Y R.Expression of interleukin 1 and interleukin 1 converting enzyme by intestinal macrophages in health and inflammatory bowel disease[J].Gut，1998，42(2)：214-219.

[36] Ludwiczek O，Vannier E，Borggraefe I，et al.Imbalance between interleukin-1 agonists and antagonists：relationship to severity of inflammatory bowel disease[J].Clin Exp Immunol，2004，138(2)：323-329.

[37] Melgar S，Karlsson A，Micha?lsson E.Acute colitis induced by dextran sulfate sodium progresses to chronicity in C57BL/6 but not in BALB/c mice：correlation between symptoms and inflammation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2005，288(6)：G1328-G1338.

[38] Siegmund B，Lehr H A，F(xiàn)antuzzi G，et al.IL-1 beta-converting enzyme(caspase-1)in intestinal inflammation[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98(23)：13249-13254.

[39] Coccia M，Harrison O J，Schiering C，et al.IL-1β mediates chronic intestinal inflammation by promoting the accumulation of IL-17A secreting innate lymphoid cells and CD4+Th17 cells[J].J Exp Med，2012，209(9)：1595-1609.

[40] Kotlarz D，Beier R，Murugan D，et al.Loss of interleukin-10 signaling and infantile inflammatory bowel disease：implications for diagnosis and therapy[J].Gastroenterology，2012，143(2)：347-355.

[41] Williams L M，Rudensky A Y.Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3[J].Nat Immunol，2007，8(3)：277-284.

[42] Vignali D A A，Collison L W，Workman C J.How regulatory T cells work[J].Nat Rev Immunol，2008，8(7)：523-532.

[43] Tang Q，Bluestone J A.The Foxp3+regulatory T cell：a jack of all trades，master of regulation[J].Nat Immunol，2008，9(3)：239-244.

[44] Fallarino F，Grohmann U，Hwang K W，et al.Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003，4(12)：1206-1212.

[45] Parkes M，Satsangi J，Jewell D.Contribution of the IL-2 and IL-10 genes to inflammatory bowel disease(IBD)susceptibility[J].Clin Exp Immunol，1998，113(1)：28-32.

[46] D’Cruz L M，Klein L.Development and function of agonist-induced CD25+Foxp3+regulatory T cells in the absence of interleukin 2 signaling[J].Nat Immunol，2005，6(11)：1152-1159.

[47] Read S，Malmstrom V，Powrie F.Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25+CD4+regulatory cells that control intestinal inflammation[J].J Exp Med，2000，192(2)：295-302.

[48] Huang C，Workman C J，F(xiàn)lies D，et al.Role of LAG-3 in regulatory T cells[J].Immunity，2004，21(4)：503-513.

[49] Karlsson F，Martinez N E，Gray L，et al.Therapeutic evaluation of ex vivo-generated versus natural regulatory T-cells in a mouse model of chronic gut inflammation[J].Inflamm Bowel Dis，2013，19(11)：2282-2294.

[50] Casado J G，Blázquez R，Vela F J，et al.Mesenchymal stem cell-derived exosomes：immunomodulatory evaluation in an antigen-induced synovitis porcine model[J].Front Vet Sci，2017，4：39.

[51] Fattore A D，Luciano R，Capolunghi F，et al.Immunoregulatory effects of mesenchymal stem cell-derived microparticles on lymphocytes[C].5th meeting of the Forum of Italian Researchers on mesenchymal and stromal stem cells，2013.

[52] 劉明，汪勁松，劉沐蕓，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體免疫調(diào)節(jié)功能的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95(32)：2630-2633.

[53] 楊翔宇，李曉紅，肖靜，等.干擾素γ刺激hUCMSCs分泌外泌體促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2017，33(1)：45-51.

[54] Souza H S P，Tortori C J A，Castelo-Branco M T L，et al.Apoptosis in the intestinal mucosa of patients with inflammatory bowel disease：evidence of altered expression of FasL and perforin cytotoxic pathways[J].Int J Colorectal Dis，2005，20(3)：277-286.

[55] Shkoda A，Werner T，Daniel H，et al.Differential protein expression profile in the intestinal epithelium from patients with inflammatory bowel disease[J].J Proteome Res，2007，6(3)：1114-1125.

[56] Rosen M J，F(xiàn)rey M R，Washington K M，et al.STAT6 activation in ulcerative colitis：A new target for prevention of IL-13-induced colon epithelial cell dysfunction[J].Inflamm Bowel Dis，2011，17(11)：2224-2234.

[57] Lai R C，Tan S S，Teh B J，et al.Proteolytic potential of the MSC exosome proteome：implications for an exosome-mediated delivery of therapeutic proteasome[J].Int J Proteomics，2012，2012：971907.

[58] von Bahr L，Sundberg B，L?nnies L，et al.Long-term complications，immunologic effects，and role of passage for outcome in mesenchymal stromal cell therapy[J].Biol Blood Marrow Transplant，2012，18(4)：557-564.

[59] Le Blanc K，Mougiakakos D.Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system[J].Nat Rev Immunol，2012，12(5)：383-396.

[60] Waterman R S，Tomchuck S L，Henkle S L，et al.A new mesenchymal stem cell(MSC)paradigm：polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype[J].PLoS One，2010，4(5)：e10088.

[61] Phinney D G，Prockop D J.Concise review：Mesenchymal stem/multipotent stromal cells：the state of transdifferentiation and modes of tissue repair-current views[J].Stem Cells，2007，25(11)：2896-2902.

[62] Djouad F，Bony C，Apparailly F，et al.Earlier onset of syngeneic tumors in the presence of mesenchymal stem cells[J].Transplantation，2006，82(8)：1060-1066.

[63] Clayton A，Harris C L，Court J，et al.Antigen-presenting cell exosomes are protected from complement-mediated lysis by expression of CD55 and CD59[J].Eur J Immunol，2003，33(2)：522-531.

[64] Yeo R W Y，Lai R C，Zhang B，et al.Mesenchymal stem cell：An efficient mass producer of exosomes for drug delivery[J].Adv Drug Deliv Rev，2013，65(3)：336-341.

[65] Alvarez-Erviti L，Seow Y，Yin H，et al.Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes[J].Nat Biotechnol，2011，29(4)：341-345.

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81573784)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.81503416)

劉與進(jìn)，男，1990年生，碩士研究生，E-mail：m201575651@hust.edu.cn

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：fanheng009@aliyun.com

R574.62

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.020

(2017-01-06 收稿)