施亞群， 羅 丹， 李 佳， 涂 璇， 郭志勇， 杜維力， 羅曉剛，3， 鄧張雙，，4*

(1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002； 2.安琪酵母股份有限公司研發(fā)中心， 湖北 宜昌 443003； 3.武漢工程大學(xué) 化工與制藥學(xué)院， 武漢 430073； 4.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 生物催化宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002)

紅豆杉內(nèi)生真菌FusariumsolaniB2-1萘酮類代謝產(chǎn)物研究

施亞群1， 羅 丹1， 李 佳1， 涂 璇1， 郭志勇1， 杜維力2， 羅曉剛1，3， 鄧張雙1，2，4*

(1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002； 2.安琪酵母股份有限公司研發(fā)中心， 湖北 宜昌 443003； 3.武漢工程大學(xué) 化工與制藥學(xué)院， 武漢 430073； 4.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 生物催化宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002)

從紅豆杉中分離得到一株內(nèi)生真菌FusariumsolaniB2-1，經(jīng)大米固體發(fā)酵以后，從乙酸乙酯提取物中分離得到4個(gè)萘酮類次級代謝產(chǎn)物1～4，鑒定為Dihydronaphthalenone(1)、5-Hydroxydihydrofusarubin C(2)、鐮紅菌素(3)和Chrysanthones B(4).其中，化合物4為首次從鐮刀霉屬(Fusarium)真菌中分離得到.化合物1～4具有微弱的抑制海分枝桿菌MycobacteriummarinumATCCBAA-535增殖活性，濃度為10 μg/mL下的抑制率分別為27.6%、25.0%、28.4%和24.4%.

紅豆杉； 內(nèi)生真菌； 萘酮； 海分枝桿菌； 結(jié)核病

天然來源的小分子化合物逐漸成為新藥發(fā)現(xiàn)的源泉.1981年～2014年間，批準(zhǔn)上市的1 211種小分子藥物中，68%的藥物直接或者間接來源于天然化合物[1].其中微生物來源的天然化合物種類多樣、結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特，是天然來源的候選藥物重要組成部分之一[2]，受到研究者越來越多的關(guān)注.

鐮刀霉屬(Fusarium)真菌可以合成多種具有萘醌母核結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物，如爪哇鐮菌素(Javanicin)[3]、鐮紅菌素(Fusarubin)[4]、茄病鐮刀菌烯醇(Solaniol)[5]和馬特鐮孢菌素(Marticin)[6]等.這類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗菌[7]、植物毒性[8]和細(xì)胞毒性[9]，受到研究者廣泛關(guān)注.課題組前期從紅豆杉(Taxus mairei)中分離鑒定39株內(nèi)生真菌，作為深入研究工作的一部分，本文探索了鐮刀屬真菌FusariumsolaniB2-1在大米發(fā)酵基質(zhì)中的次級代謝產(chǎn)物情況，從中分離鑒定4種萘酮類化合物.同時(shí)，評價(jià)了4種化合物抑制海分枝桿菌增殖活性.

1儀器與材料

核磁共振譜在Bruker-ARX-400核磁共振譜儀上測定，內(nèi)標(biāo)為TMS；化合物1和3的HRMS在Q Exactive Focus四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀上測定；化合物2和4的HRMS在Agilent 5500四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀上測定；化合物純化和純度測定在Waters 1525EF高效液相色譜儀上進(jìn)行，制備型色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18，5 μm，100 ?，10×250 mm，分析型色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18，5 μm，100 ?，4.6×250 mm.柱層析硅膠(200～300目)、薄層層析硅膠板(200 mm×200 mm)均購自青島海洋化工廠；凝膠填料為Sephadex LH-20.

紅豆杉樣品2013年04月采自湖北省神龍架林區(qū)，由三峽大學(xué)生物技術(shù)中心王玉兵副教授鑒定為Taxusmairei.內(nèi)生真菌B2-1采用傳統(tǒng)劃線分離方式(分離培養(yǎng)基為PDA)分離自紅豆杉樹皮，經(jīng)rDNA-ITS序列測定，鑒定為腐皮鐮刀菌Fusariumsolani.

2提取與分離

內(nèi)生真菌FusariumsolaniB2-1采用大米培養(yǎng)基質(zhì)室溫培養(yǎng)28 d，發(fā)酵培養(yǎng)基用等體積的乙酸乙酯室溫超聲提取3次，過濾固體物質(zhì)，減壓濃縮后得浸膏4.3 g，經(jīng)1500 mL甲醇/正己烷體系(V/V=2/1)分散，減壓濃縮得甲醇部位浸膏2.2 g.甲醇部位經(jīng)硅膠柱分離，氯仿/甲醇(V/V=100/1， 100/2， 100/5， 100/10， 100/20和0/100)洗脫，TLC及HPLC-DAD分析，合并相同組分，最終得到12個(gè)片段.其中片段2(402 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，氯仿/甲醇(V/V=1/1)洗脫得到9個(gè)片段，其中片段7(125 mg)經(jīng)制備型HPLC分離純化(CH3CN/H2O，V/V=75/25)，分別得到化合物1(12.7 mg，tR=16.5 min)，2(12.0 mg，tR=18.8 min)，3(10.0 mg，tR=23.8 min)和4(9.0 mg，tR=27.0 min).

3抗海分枝桿菌活性評價(jià)

7H10-OADC固體培養(yǎng)基上挑取野生型海分枝桿菌MycobacteriummarinumATCCBAA-535(由上海復(fù)旦大學(xué)高謙教授饋贈)接種于7H9-OADC培養(yǎng)基，置于透氣培養(yǎng)瓶中，32℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(100 r/min)至早期對數(shù)生長期(OD600 nm=0.5～1.0).常溫10 000 r/min離心；小心倒掉上清液，加入5～10粒無菌玻璃小珠，劇烈震蕩2 min以打散細(xì)菌成單細(xì)菌.重懸于7H9-OADC培養(yǎng)基并將OD600 nm值調(diào)整至0.1.按1∶10倍比稀釋至OD600 nm=0.001.使用U型底的96孔板，每孔加入50 μL 7H9-OADC培養(yǎng)基.在96孔板的最上面一行(共12個(gè)孔)，每孔加入含有4倍最高檢測濃度抗生素的7H9-OADC培養(yǎng)基50 μL.例如利福平的最高檢測濃度為10 μg/mL，則加入含40 μg/mL利福平的7H9-OADC培養(yǎng)基50 μL.加入后，第一行孔中的抗生素濃度變?yōu)?0 μg/mL.將96孔板每列(共8個(gè)孔)按從上倒下的順序，以1∶2的梯度進(jìn)行倍比稀釋.將準(zhǔn)備好的細(xì)菌懸浮液加入到96孔板中，小心使用Parafilm膜封板，置于32℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7 d后進(jìn)行肉眼觀察，將細(xì)菌明顯出現(xiàn)生長的所對應(yīng)的最小抗生素濃度定位MIC，并在7H10平板上予以驗(yàn)證，驗(yàn)證方法與前述SDS壓力檢測方法相同.陽性對照藥物為利福平(RIF).結(jié)果顯示：化合物1～4具有微弱的抑制海分枝桿菌MycobacteriummarinumATCCBAA-535增殖活性，濃度為10 μg/mL下的抑制率分別為27.6%、25.0%、28.4%和24.4%，化合物1～4的IC50>200 μM，陽性對照藥物利福平的IC50值為0.55 μM.

4結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:淡紅色無定形粉末，HR-ESI-MSm/z: 293.1013 [M+H]+(calcd for C15H17O6， 293.1025)，分子式為C15H16O6.1H NMR(400 MHz， CDCl3)δ: 11.66 (1H， s， OH-8)， 6.39 (1H， s， H-7)， 5.39 (1H， s， OH-5)， 5.35 (1H， s， H-4)， 4.19 (1H， dd，J=5.6， 9.3 Hz， H-13α)， 3.93 (3H， s， H-12)， 3.77 (1H， d，J=9.3 Hz， H-13β)， 2.99 (1H， d，J=5.6 Hz， H-2)， 2.88 (1H， dd，J=5.8， 8.0 Hz， H-3)， 2.77 (1H， dd，J=8.0， 18.0 Hz， H-9α)， 2.49 (1H， dd，J=5.8， 18.0 Hz， H-9β)， 2.20 (3H， s， H-11);13C NMR (100 MHz， CDCl3)δ: 205.8 (C-10)， 203.5 (C-1)， 158.9 (C-8)， 154.2 (C-6)， 134.5 (C-5)， 127.6 (C-4a)， 107.3 (C-8a)， 99.0 (C-7)， 74.6 (C-4)， 66.4 (C-13)， 56.4 (C-12)， 54.1 (C-2)， 44.0 (C-3 & C-9)， 30.3 (C-11). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故化合物1鑒定為Dihydronaphthalenone.

化合物2:淡紅色無定形粉末，HR-ESI-MSm/z: 311.1151 [M+H]+(calcd for C15H19O7， 311.1131)，分子式為C15H18O7.1H NMR(400 MHz， CDCl3)δ: 12.00 (1H， s， OH-9)， 6.48 (1H， s， H-8)， 5.65 (1H， br s， OH-6)， 5.35 (1H， d，J=2.6 Hz， H-5)， 4.01 (1H， dd，J=8.3， 11.5 Hz， H-1α)， 3.96 (3H， s， H-12)， 3.93 (1H， d，J=4.6 Hz， OH-5)， 3.81 (1H， dd，J=9.8， 11.5 Hz， H-1β)， 3.02 (1H， ddd，J=3.9， 8.7， 9.8 Hz， H-10a)， 2.94 (1H， m， H-4a)， 2.04 (1H， d，J=11.6 Hz， H-4α)， 2.00 (1H， dd，J=4.2， 11.6 Hz， H-4β)， 1.60 (3H， s， H-11);13C NMR (100 MHz， CDCl3)δ: 203.1 (C-10)， 158.7 (C-9)， 154.4 (C-7)， 137.8 (C-6)， 121.1 (C-5a)， 107.2 (C-9a)， 106.3 (C-3)， 100.2 (C-8)， 72.0 (C-5)， 62.8 (C-1)， 56.5 (C-12)， 45.0 (C-10a)， 40.1 (C-4)， 38.9 (C-4a)， 23.9 (C-11). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故化合物2鑒定為5-Hydroxydihydrofusarubin C.

化合物3:紅色無定形粉末，HR-ESI-MSm/z: 307.0808 [M+H]+(calcd for C15H15O7， 307.0818)，分子式為C15H14O7.1H NMR(400 MHz， CDCl3)δ: 12.95 (1H， s， OH-10)， 12.68 (1H， s， OH-5)， 6.19 (1H， s， H-8)， 4.90 (2H， m， H-1)， 3.94 (3H， s， H-12)， 3.04 (1H， d，J=18.2 Hz， H-4α)， 2.72 (1H， d，J=18.2 Hz， H-4β)， 2.28 (1H， s， OH-3)， 1.66 (3H， s， H-11).13C NMR (100 MHz， CDCl3)δ: 184.7 (C-9)， 178.2 (C-6)， 160.8 (C-5)， 160.7 (C-7)， 157.4 (C-10)， 137.2 (C-4a)， 132.9 (C-10a)， 109.8 (C-5a)， 109.7 (C-9a)， 107.7 (C-8)， 94.3 (C-3)， 58.6 (C-1)， 56.7 (C-12)， 32.2 (C-4)， 29.5 (C-11). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故化合物3鑒定為Fusarubin.

化合物4:褐色無定形粉末，HR-ESI-MSm/z: 277.1096 [M+H]+(calcd for C15H17O5， 277.1076)，分子式為C15H16O5.1H NMR(400 MHz， CDCl3)δ: 12.50 (1H， s， OH-10)， 6.68 (1H， s， H-5)， 5.58 (1H， s， H-4)， 5.23 (1H， d，J=13.4 Hz， H-1α)， 5.17 (1H， d，J=13.4 Hz， H-1β)， 4.79 (1H， dd，J=3.0， 7.5 Hz， H-6)， 3.91 (1H， ddd，J=3.0， 3.4， 6.6 Hz， H-7)， 3.49 (3H， s， H-12)， 3.10 (1H， dd，J=6.6， 17.5 Hz， H-8α)， 2.78 (1H， dd，J=3.4， 17.5 Hz， H-8β)， 2.60 (1H， d，J=7.5 Hz， OH-6)， 1.95 (3H， s， H-11).13C NMR(100 MHz， CDCl3)δ: 199.9 (C-9)， 160.3 (C-3)， 157.4 (C-10)， 142.9 (C-5a)， 141.1 (C-4a)， 113.6 (C-9a)， 113.3 (C-5)， 112.3 (C-10a)， 100.9 (C-4)， 78.3 (C-7)， 68.9 (C-6)， 63.2 (C-1)， 57.0 (C-12)， 38.9 (C-8)， 20.0 (C-11). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故化合物4鑒定為Chrysanthones B.

5結(jié)論

本文所述的4種萘酮類化合物具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，在215，243，282和355 nm處有明顯的紫外吸收，因此可以根據(jù)UV吸收特征指導(dǎo)化合物定向分離.萘酮類化合物具有結(jié)構(gòu)多樣性特征，主要表現(xiàn)為環(huán)的氫化、環(huán)的開裂、環(huán)的羥基化以及環(huán)羥基的氧化等，在微生物和植物體內(nèi)廣泛分布.同時(shí)萘酮類化合物具有抗菌、抗蟲、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，化學(xué)、藥理學(xué)領(lǐng)域越來越多的研究者關(guān)注此類化合物.

本文從紅豆杉內(nèi)生真菌FusariumsolaniB2-1大米發(fā)酵物中分離得到4個(gè)萘酮類次級代謝產(chǎn)物1～4，鑒定為Dihydronaphthalenone(1)、5-Hydroxydihydrofusarubin C(2)、鐮紅菌素(3)和Chrysanthones B(4).其中，化合物4為首次從鐮刀霉屬(Fusarium)真菌中分離得到.所有化合物進(jìn)行了抑制海分枝桿菌MycobacteriummarinumATCCBAA-535增殖活性評價(jià)，數(shù)據(jù)顯示具有微弱的增殖抑制作用.后續(xù)研究可通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾和生物合成途徑干預(yù)豐富此類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性，提升抗海分枝桿菌抑制活性.

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Study on naphthalenones from endophytic fungusFusariumsolaniB2-1 isolated from Taxus mairei

SHI Yaqun1， LUO Dan1， LI Jia1， TU Xuan1， GUO Zhiyong1， DU Weili2， LUO Xiaogang1，3， DENG Zhangshuang1，2，4

(1.Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development， College of Biological and Pharmaceutical Sciences， China Three Gorges University， Yichang， Hubei 443002; 2.Research and Development Center， Angel Yeast Co.， Ltd.， Yichang， Hubei 443003; 3.School of Chemical Engineering & Pharmacy， Wuhan Institute of Technology， Wuhan 430073; 4.Yichang Key Laboratory of Biocatalysis， College of Biological and Pharmaceutical Sciences， China Three Gorges University， Yichang， Hubei 443002)

Four naphthalenones (1～4)， including dihydronaphthalenone (1)， 5-hydroxydihydrofusarubin C (2)， Fusarubin (3) and Chrysanthones B (4)， were isolated from an EtOAc extract derived from a solid culture of the endophytic fungal strainFusariumsolaniB2-1， which originated from Taxus mairei. Compound 4 was firstly isolated from the fungi of the genusFusarium. All compounds 1～4 showed weak inhibitory activity againstMycobacteriummarinumATCCBAA-535 with inhibitory rate of 27.6%， 25.0%， 28.4% and 24.4% at a concentration of 10 μg/mL， respectively.

Taxusmairei; endophytic fungus; naphthalenone;Mycobacteriummarinum; tuberculosis

2016-10-11.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31100080)；天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué))開放基金項(xiàng)目(2015NP02，2016NP03).

1000-1190(2017)02-0173-04

R914.4

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: dzs163@163.com.