盧林竹，胡志希，李 琳*，黃鑫玲，凌志強，左世國，劉思凱,李 杰

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

“以方測證”法在動物模型研究中的運用

盧林竹，胡志希，李 琳*，黃鑫玲，凌志強，左世國，劉思凱,李 杰

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

近年來“以方測證”法廣泛運用于實驗動物證型研究，推動中醫(yī)藥研究發(fā)展的同時也引起了不少質(zhì)疑?，F(xiàn)針對近年來的相關(guān)文獻，從理論基礎(chǔ)、存在的問題、改進的方案與設(shè)想等方面進行綜述，旨在為以后的實驗研究提供新的思路。

以方測證；動物模型；證型；方證對應(yīng)

實驗動物模型的應(yīng)用對醫(yī)學(xué)的發(fā)展有重要影響，也是現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中不可或缺的手段。隨著現(xiàn)代中醫(yī)證候?qū)W的不斷發(fā)展，關(guān)于實驗動物的研究逐漸深入，目前建立動物證型模型的途徑主要有兩種[1]，一是正向思維，即盡可能的收集動物“四診資料”，據(jù)此來判斷證型[2]；二是逆向思維，即“以方測證”?！耙苑綔y證”或“以藥測證”是基于方證對應(yīng)理論，依據(jù)方劑的功效或其組成藥物的功效，推測或反證其對應(yīng)證候的屬性[3]，應(yīng)用于實驗動物模型中，首先要建立某種預(yù)設(shè)證的模型，再給予針對預(yù)設(shè)證的方劑，對由方藥處理后的模型動物進行觀測，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方法分析后，確認方藥能夠改善可能與預(yù)設(shè)證有關(guān)的異常指標(biāo)，據(jù)此來判定該模型為預(yù)設(shè)證模型[4]。鑒于建立動物模型的工作將對今后中醫(yī)診斷學(xué)領(lǐng)域的研究以及方藥的臨床應(yīng)用意義重大，本文就近年來“以方測證”的關(guān)鍵問題進行了系統(tǒng)的分析和綜述。

1 理論基礎(chǔ)

“以方測證”作為一種方法，最初應(yīng)用于中醫(yī)理論文獻研究中[5]：《傷寒論》第351條：“手足厥寒，脈細欲絕者，當(dāng)歸四逆湯主之?！眱H從原文所描述的一脈一癥中，很難判斷當(dāng)歸四逆湯所對應(yīng)的證型和主治的具體病癥，而《傷寒論》《金匱要略》中類似于此的條文比比皆是，因此后世學(xué)者、醫(yī)家大多采用“以方測證”的方法進行反證，根據(jù)反證的結(jié)果和臨床經(jīng)驗成功地完善了中醫(yī)學(xué)方證理論體系。

從方法學(xué)的角度來講，“以方測證”法具有“方證對應(yīng)”的邏輯基礎(chǔ)[5]。有是證則用是方，方藥與證候具有直接的對應(yīng)關(guān)系，臨床上無論采用何種辨證方法，最終必須病證相合、藥證相符，才能取得臨床療效[6]。而由于動物實驗的不確定性和中醫(yī)證候的復(fù)雜性，利用方藥進行反證便十分重要，更有學(xué)者認為在中醫(yī)“證”的動物模型中，方藥治療是檢驗“證”的最可靠方法[7]。

2 動物實驗中的運用

中醫(yī)診斷主要依靠“望、聞、問、切”來辨證論治，而由于人體與實驗動物的差異性，中醫(yī)診斷中的四診資料在實驗過程中難以獲取，以至于往往無證可辨。因此，“以方測證”推測動物的證型成為近年來中醫(yī)動物實驗的重要手段，而大部分學(xué)者的研究思路主要集中于以下幾點。

2.1 驗證動物模型

楊雯晴等使用“以方測證”法驗證原發(fā)性高血壓動物模型具有肝陽上亢證的特點[8]；劉瑩等復(fù)制腎氣虛哮喘大鼠病證結(jié)合模型并利用益腎喘寧片反證[9]；劉欣等通過右歸丸“以方測證”確定以1.25 mL/(kg·d)薄荷油造模21 d的大鼠在一定程度可以模擬臨床陽虛證的狀態(tài)[10]；黃晶晶等探討高濃度番瀉葉灌胃及負重游泳構(gòu)建腹瀉病氣陰兩虛證模型并通過“以方測證”反證建模成功[11]；鄭兆曄等從“以方測證”的角度驗證肺纖維化（氣虛血瘀證）大鼠模型制作成功[12]。

2.2 討論證候?qū)傩?/p>

樊訊通過“以方測證”法證明心梗后心衰心陽虛證候大鼠在證候上兼有脾陽虛水停之證，可能為脾陽虛兼水停，或心脾兩虛兼水停[13]；柴程芝等以慢性間歇性缺氧為造模手段，誘導(dǎo)動物表現(xiàn)出消瘦，煩躁，脈細數(shù)等氣陰兩虛證的臨床特點，并采用生脈散及丹參類方在不同時程加以干預(yù)，動態(tài)考察模型的證候?qū)傩訹14]；全世建等通過“以方測證”的方法，采用高效液相法觀察大鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì) (5-HT、NE、E、 DA)及放免法檢測血中ACTH的含量變化，初步推測對氯苯丙胺酸所致大鼠失眠模型的證候?qū)傩耘c中醫(yī)心腎不交型類似[15]；林輝利用“以方測證”法，選取具有活血化瘀、補氣、行氣、清利濕熱以及養(yǎng)陰作用的代表方劑對抗CCl4對肝纖維化模型大鼠造成的慢性肝損傷，推測肝硬化形成以前的慢性肝損傷中醫(yī)病機可能為濕熱、氣滯以及陰虛[16]；姜楠等用“以方測證”法探討糖代謝異常的代謝綜合征（MS）大鼠可能出現(xiàn)痰熱互結(jié)證、陰虛熱盛證、肝胃郁熱證、血瘀脈絡(luò)證[17]。

2.3 反向驗證藥物的療效

高昂等探索脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的建立方法并觀察四神丸加味對模型的治療效果，發(fā)現(xiàn)四神丸加味可以改善模型大鼠的相關(guān)癥狀及體征[18]；王英娜等由低碘致甲減機體的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)補中益氣湯可以較好地改善甲狀腺功能及形態(tài)[19]；邊艷琴通過“以方測證”法闡明了茵陳蒿湯、茵陳五苓散和梔子柏皮湯都可以改善大鼠肝纖維化，但綜合比較茵陳蒿湯組作用最優(yōu)[20]。

2.4 比較同病異治中不同藥物的療效差異

巨少華等基于“以方測證”思路，以佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠疾病模型為載體，平行比較寒熱主證不同的烏頭湯、白虎加桂枝湯和桂枝芍藥知母湯的藥效及機制異同，為中醫(yī)“同病異治”提供實驗依據(jù)[21]。

3 存在的問題

3.1 實驗對照設(shè)立不合理，缺乏排他性

宋紅等學(xué)者在建立脾氣虛證大鼠模型中用 “以方測證”法來反證造模成功與否，選擇方劑時只選用了黃芪建中湯，并未設(shè)立其他方劑的對照組或空白組[22]，慣性地排除了其他潛在證候，不具有嚴謹?shù)呐潘?，得出的結(jié)論容易受到質(zhì)疑，缺乏說服力。當(dāng)然，已經(jīng)有學(xué)者注意到這一點，但縱觀現(xiàn)有的實驗研究資料，設(shè)立對照仍過于簡單，存在很多不合理的因素，實驗方案有待進一步改進。

3.2 檢測指標(biāo)不具有特異性

很多學(xué)者在微觀辨證與宏觀辨證相結(jié)合的方面發(fā)現(xiàn)了很多微觀指標(biāo)，然而這些指標(biāo)大部分都缺少中醫(yī)學(xué)特色，也不能夠廣泛運用于中醫(yī)學(xué)實驗，缺少普遍性。同時，由于人與實驗動物的差異性，這些能夠反映實驗動物證型的理化指標(biāo)是否可以同樣反映人的證型也有待商榷。

3.3 “方證對應(yīng)”具有相對性

中醫(yī)方與證之間的關(guān)系并不是鎖定關(guān)系，一個證型有許多方劑可以進行治療，均可取得療效，但療效有差異，因此方證之間的相關(guān)性蘊涵著相關(guān)程度大小的問題，只有用藥配伍與特定病證的病機高度相關(guān)的治療方藥才可能取得最好的療效，然而在現(xiàn)代中醫(yī)證候模型研究中，僅以某方治療某動物模型有效來判定模型的方證性質(zhì)顯然是不可靠的，因為實際上作用于該模型的有效方劑可能不只是一個[4]。另外，“方證對應(yīng)”的相對性也體現(xiàn)在中醫(yī)的辨證類型的多樣性（八綱辨證、臟腑辨證、氣血津液辨證等），由于辨證思路的差異，造成了相關(guān)的評價標(biāo)準更加難以把握。

3.4 方藥具有多效用性

由方藥的多效性可知，同一個方劑往往有不同的作用，如益氣健脾、補血養(yǎng)心的歸脾湯既能治療心脾氣血兩虛證，又能治療脾不統(tǒng)血證，那么在“以方測證”時，歸脾湯所對應(yīng)的動物證型究竟是心脾氣血兩虛證還是脾不統(tǒng)血證？方證并不能一一對應(yīng)，因而缺乏特異性。

3.5 在邏輯學(xué)上“以方測證”是“無效”的

有學(xué)者認為“以方測證”法不是“永真式”的，“以病機命名的證候”與“以方劑命名的證候”不具有同一性，“以方測證”有可能得到“以病機命名的證候”與“以方劑命名的證候”相互交叉的部分，但那是偶然而非必然[23]；由于方藥對于證型并沒有一對一的關(guān)系，而藥物反證無效不一定不對證，故而這種“以方測證”的認定不具有特異性[24]。

4 改進的方案及設(shè)想

4.1 建立合適的對照組

以研究慢性腎衰大鼠模型為例：分別建立慢性腎病模型組、溫補腎陽方藥驗證組、滋腎陰清熱方藥驗證組、正常對照組，用腺嘌呤制高尿酸血癥腎損害模型，分別用龜鹿補腎口服液、知柏地黃丸、生理鹽水灌胃，觀察血清尿素、肌酐含量，并與正常對照組對比，結(jié)果證明腺嘌呤所致慢性腎功能衰竭動物模型屬于中醫(yī)腎陽虛證侯模型[25]。另外有學(xué)者建議應(yīng)用“類療對照”“拆方對照”“同一方劑在不同證的對照”“推測性對照”“同一疾病同一證型中，功效部分相同或類似的方劑效應(yīng)對照”等方法來完善以方測證的內(nèi)容[3]。如涂星根據(jù)“拆方對照”原理，將成功的腸預(yù)激綜合征腹瀉型（IBS-D）模型隨機分為四逆散組、痛瀉要方組、腸激安方組和模型對照組，另取正常大鼠作為空白對照[26]。

4.2 或可引用生物代謝組學(xué)，選擇檢測指標(biāo)

代謝組學(xué)采用全面而系統(tǒng)的方法來理解生理病理過程，與中醫(yī)的整體觀和“司外揣內(nèi)”的思維模式有諸多相通之處。其研究思路為：生物體系受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后），其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物在種類、數(shù)量上將產(chǎn)生規(guī)律性變化[27]。王米渠等用基因芯片法發(fā)現(xiàn)寒證的基因表達譜有顯著差異，在59條差異表達基因中，大多數(shù)與代謝（能量代謝、蛋白質(zhì)代謝等）有關(guān)[28]；張北華發(fā)現(xiàn)IBS-D肝郁脾虛證大鼠模型結(jié)腸和腦組織中存在大量差異表達的蛋白，部分蛋白與臨床報道一致，該模型具備IBS-D的病理特征[29]；羅和古等建立大鼠肝郁脾虛模型，通過代謝組學(xué)，可以找到中醫(yī)證候的生物學(xué)基礎(chǔ)[30-31]；童寧寧對慢性胃炎濕熱蘊脾證患者和正常組唾液進行了代謝產(chǎn)物分析，兩組代謝產(chǎn)物有明顯區(qū)別，說明慢性胃炎濕熱蘊脾證同唾液代謝產(chǎn)物有一定的相關(guān)性[32]；朱曉霞以前期蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果作為切入點，提出β-arrestin2是介導(dǎo)PP2A-Akt-mTOR、ERK-BDNF信號通路、調(diào)控肝郁海馬突觸可塑性的關(guān)鍵分子，是肝郁證形成的新靶標(biāo)[33]。

4.3 多角度、多層次、多方位、多指標(biāo)相結(jié)合

例如模型動物的表現(xiàn)，方藥對模型動物癥狀的改善情況，各層次上的微觀指標(biāo)改變，以及各對照觀察組的各項指標(biāo)變化進行比較等[34]。如楊雯晴等提出，對原發(fā)性高血壓肝陽上亢證的判定從以下角度協(xié)同進行：從中藥藥物的反證進行推測，與證候相關(guān)的理化指標(biāo)，以及模型動物的宏觀體征與行為表現(xiàn)[5]。并可以考慮通過病癥證的手段以及利用藥物的性味歸經(jīng)等特點完善“以方測證”的實驗思路。

4.4 選擇經(jīng)典方劑

如陰虛狀態(tài)使用六味地黃丸、左歸丸來治療反證，而陽虛狀態(tài)則常用右歸丸、金匱腎氣丸等經(jīng)典方及附子、肉桂、巴戟天、淫羊藿等藥物[35]。自由加減的方劑沒有統(tǒng)一的標(biāo)準，容易發(fā)生歧義，不具有說服力[1，5，36]。

動物實驗方法被引入中醫(yī)藥研究領(lǐng)域?qū)嶋H上是新的科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)學(xué)理論的碰撞和融合，其中難免會有波折，而“以方測證”法雖然在實驗過程中暴露了諸多問題，但因其簡便易行、效果明顯等優(yōu)點，仍然被廣泛運用。我們應(yīng)當(dāng)采取科學(xué)的、積極的態(tài)度,認真審視與理性分析“以方測證”的研究中存在的各種問題，使其在中醫(yī)藥研究中發(fā)揮更大的價值。

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（本文編輯 楊 瑛）

Application of"Syndrome Differentiation through Formula Effect Assessment"in Experimental Animals Models Research

LU Linzhu,HU Zhixi,LI Lin*,HUANG Xinling,LING Zhiqiang,ZUO Shiguo,LIU Sikai,LI Jie (Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

In recent years,the method of"Syndrome Differentiation through Formula Effect Assessment"is widely applied to the study ofthe syndrome typesofexperimentalanimals,which isofgreatsignificance to the research and development of traditional Chinese medicine.This paper is reviewed from the theoretical basis,existing problems,improved scheme and assumption based on the related literatures,which could provide new thought for experimental research.

syndrome differentiation through formula effect assessment;animal models;pattern of syndrome;coordination between formula and pattern

R285.5；R521

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.028

2016-06-23

國家自然科學(xué)基金項目 (81373550,81503627)；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目；湖南省教育廳基金項目（15C1054）。

盧林竹，女，在讀本科生，研究方向：心血管病證本質(zhì)與規(guī)律研究。

*李 琳，女，助教，主要從事心血管病證本質(zhì)與規(guī)律研究，E-mail:lilin6527@qq.com

本文引用：盧林竹，胡志希，李 琳，黃鑫玲，凌志強，左世國，劉思凱,李 杰.“以方測證”法在動物模型研究中的運用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017,37(5):570-573.