楊震　姚順　蘇晨　張小宇　陶軍

摘要：目的 本研究旨在觀察切應(yīng)力對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外功能和內(nèi)皮修復(fù)能力的影響，以探討切應(yīng)力介導(dǎo)細(xì)胞修復(fù)血管損傷的可能性。方法 分離培養(yǎng)及鑒定外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞，予以低切應(yīng)力（5 dyn/cm2）、中切應(yīng)力（15 dyn/cm2）和高切應(yīng)力（25 dyn/cm2）處理，并觀察不同水平和時(shí)間切應(yīng)力對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外功能和修復(fù)血管損傷能力的影響。結(jié)果 切應(yīng)力處理后，內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、黏附和增殖功能明顯增加，并且這種作用呈時(shí)間和劑量依賴性。將內(nèi)皮祖細(xì)胞移植至裸鼠血管損傷模型，經(jīng)切應(yīng)力處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞能更有效的加快損傷血管再內(nèi)皮化，修復(fù)血管損傷。結(jié)論 切應(yīng)力顯著增加內(nèi)皮祖細(xì)胞體外功能和內(nèi)皮修復(fù)能力，表明切應(yīng)力介導(dǎo)的細(xì)胞療法是修復(fù)血管內(nèi)皮損傷的有效策略之一。

關(guān)鍵詞：內(nèi)皮祖細(xì)胞；切應(yīng)力；血管損傷；再內(nèi)皮化； 內(nèi)皮修復(fù)

近來研究表明，來源于骨髓、臍血、外周血，具有特定細(xì)胞表面標(biāo)志物的內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor cells， EPCs）能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并能夠加速血管再內(nèi)皮化、修復(fù)血管損傷及參與血管新生，是干細(xì)胞移植療法修復(fù)血管內(nèi)皮損傷重要的種子細(xì)胞。研究表明，存在心血管病危險(xiǎn)因素和冠心病發(fā)生時(shí)，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能和數(shù)量受損，反映血管內(nèi)皮損傷修復(fù)能力下降[1-2]，因此，有效改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能是修復(fù)內(nèi)皮損傷和防治冠心病等心血管疾病的重要措施。

現(xiàn)普遍認(rèn)為切應(yīng)力是在血管內(nèi)皮頂端由血流產(chǎn)生的摩擦力，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞很多功能蛋白的基因表達(dá)以及對(duì)血管的內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)具有有利影響。最近研究發(fā)現(xiàn)，切應(yīng)力促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、分化到成熟內(nèi)皮細(xì)胞。我們前期研究表明切應(yīng)力促進(jìn)人EPC的t-PA、 eNOS和SOD表達(dá)，并提高體外高通暢率的EPCs種植的小徑人工血管的抗血栓生成能力，表明切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮的有利效應(yīng)是基于EPC功能的改善。切應(yīng)力可增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的抗血栓形成能[2]，是改善EPCs功能活性的一種非藥理學(xué)的重要手段。

1資料與方法

1.1材料與試劑 EGM-2培養(yǎng)基購于Clonetics公司，纖維連接蛋白購于Hematologic Technologies公司， PBS購于Invitrogen GibcoTM公司，ac-LDL購于Molecular Probes公司，Lectin購于Sigma公司，VWF免疫熒光抗體一抗購于Serotec公司，，F(xiàn)LK-1免疫熒光抗體一抗購于Neomarker公司， 8～10周齡雄性無胸腺乳鼠 NRMInu/nu，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2細(xì)胞分離培養(yǎng)和早期EPCs鑒定 取健康成人外周血 （N=6）約40 ml置于肝素管中，并以PBS稀釋。加入Ficoll-Pague分離液后離心約2000rpm 20 min，小心提取血清和Ficoll分離液交界處的單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗滌兩次，置于以纖維連接蛋白預(yù)襯的EGM-2培養(yǎng)基中。將上述含有外周血單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)基置于含有5 % CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后，洗去不貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞則培養(yǎng)第7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

免疫熒光標(biāo)記鑒定：細(xì)胞培養(yǎng)2 w后取一部分貼壁細(xì)胞在一定濃度ac-LDL溶液中孵育1 h，然后以20 ml/L的4%多聚甲醛固定，以一定濃度lectin抗體溶液孵育1h，并置于熒光顯微鏡下觀察拍片，紅色和綠色雙染色細(xì)胞為EPC。

1.3切應(yīng)力實(shí)驗(yàn) 胰酶消化EPC后種植于小徑聚氨酯人工血管，置于兩端密閉的試管中，以 6 r/h的速度均勻鋪墊1 d，之后將制備的人工血管接裝于體外切應(yīng)力處理灌流裝置上，分為靜態(tài)組、低切應(yīng)力組（5 dyn/cm）、中切應(yīng)力組（15 dyn/cm ）和高切應(yīng)力組（25 dyn/cm）4個(gè)不同處理組予以處理（n=6）。附著的EPC置于5，15，25 dyn/cm2的切應(yīng)力處理24 h或以15 dyn/cm2條件分別處理5，10，20 h。切應(yīng)力通過等式T=6 Qu/bh2計(jì)算，T為切應(yīng)力，Q為流量，u為介質(zhì)粘度，b為通道寬度，h為通道高度。對(duì)照組的EPCs均維持在靜態(tài)環(huán)境。所有實(shí)驗(yàn)都在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

1.4內(nèi)皮祖細(xì)胞體外功能 檢測(cè)EPCs遷移功能：將含 50 ng/mlVEGF 的DMEM培養(yǎng)液加入改良Boyden小室的下室， 用2.5 g/L胰酶消化貼壁細(xì)胞，懸浮于DMEM培養(yǎng)液中。將含 50 ng/ml懸浮在500 ul DMEM 培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24 h后，輕輕刮去濾膜上面的未遷移細(xì)胞，用甲醇固定，Giemsa溶液染色，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。

檢測(cè)EPCs增殖功能：EPC培養(yǎng)7 d后，如上述用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，懸浮于DMEM培養(yǎng)液中。將相同數(shù)量的EPC接種到包被有人纖維連接蛋白96孔培養(yǎng)板，每孔加10μL MTT （5 g/L），培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，再加入二甲基亞砜（150μL/孔）充分振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀下于波長490 nm處測(cè)A值。

檢測(cè)EPCs黏附功能： 培養(yǎng)14 d EPCs胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液， 將等量的 EPCs 接種在包被有人纖維連接蛋白培養(yǎng)板，在置 5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，PBS 洗去除未黏附的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定及1%蘇木素染色細(xì)胞核 ， 顯微鏡下隨機(jī)選取 5個(gè)視野（×200） ，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞 ，取其平均數(shù)。

1.5動(dòng)物模型和再內(nèi)皮化試驗(yàn) 對(duì)8～10周齡雄性無胸腺乳鼠NRMI nu/nu移植人EPCs。利用氯胺酮（100 mg/kg IP）和甲苯噻嗪（5 mg/kg IP）對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉。使用解剖顯微鏡進(jìn)行手術(shù)。在靠近腹側(cè)頸部作一個(gè)中線切口，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈。定位頸動(dòng)脈分支處，對(duì)頸外動(dòng)脈近端遠(yuǎn)端兩處放置結(jié)扎細(xì)線，結(jié)扎遠(yuǎn)端處細(xì)線。然后于兩細(xì)線之間血管作切口。使用彎曲導(dǎo)絲（直徑0.35 mm）插入頸總動(dòng)脈，前后拉動(dòng)三次損傷內(nèi)皮。撤去導(dǎo)絲，對(duì)頸外動(dòng)脈近端的細(xì)線進(jìn)行結(jié)扎。

再內(nèi)皮化試驗(yàn)：將EPCs（5×105細(xì)胞）置于100 μl預(yù)熱的PBS溶液（37 °C），頸部手術(shù)3 h后，通過尾靜脈將EPCs注射入乳鼠體內(nèi)。同樣容量的PBS作為安慰劑注射到對(duì)照組乳鼠體內(nèi)。手術(shù)3 d后，通過尾靜脈注射50 μl含伊文思藍(lán)的溶液染色內(nèi)皮損傷區(qū)對(duì)內(nèi)皮再生能力進(jìn)行評(píng)估。使用熒光顯微鏡探測(cè)移植的EPCs歸巢置血管損傷區(qū)域。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS V11.0。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在兩組間使用t檢驗(yàn)，三組及四組間數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1早期EPCs特征 培養(yǎng)7 d后，外周血分離得到的單核細(xì)胞表現(xiàn)為典型的"紡錘樣"梭形細(xì)胞。熒光顯微鏡下，貼壁細(xì)胞吞噬DiI-acLDL熒光染色陽性為紅色，lectin抗體熒光染色陽性為綠色，DiI-acLDL和 FITC-lectin雙染色陽性為內(nèi)皮祖細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析，貼壁細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮特定標(biāo)志物CD31，vWF和KDR以及單核標(biāo)志物CD14，該貼壁細(xì)胞為EPCs。

2.2切應(yīng)力上調(diào)EPCs體外功能 培養(yǎng)7 d后， EPCs分別置于5，15，25 dyn/cm2條件下的切應(yīng)力20 h。切應(yīng)力提高EPCs的遷移能力（n=6，P<0.05）及增殖能力（n=6，P<0.05），并且呈劑量依賴性。切應(yīng)力激活EPCs黏附功能（（n=6，P<0.05）。之后將EPCs分別置于15 dyn/cm2切應(yīng)力條件下5，10和20 h，對(duì)照組EPC處于靜態(tài)條件，切應(yīng)力明顯提EPCs遷移能力（n=6，P<0.05），EPCs置于切應(yīng)力處理6 h后， EPCs黏附能力（n=6，P<0.05）和增殖能力（n=6，P<0.05）均明顯提高。在切應(yīng)力處理5～20 h的過程中，EPC遷移，黏附和增殖能力開始緩慢增加。

2.3切應(yīng)力促進(jìn)體內(nèi)EPCs再內(nèi)皮化 為了證實(shí)切應(yīng)力是否上調(diào)EPCs體外功能及加速體內(nèi)再內(nèi)皮化能力，將EPCs置于在15 dyn/cm2切應(yīng)力條件下20 h后，注入頸動(dòng)脈損傷術(shù)后的裸鼠。熒光顯微鏡下看到EPCs定位在動(dòng)脈損傷部位。EPCs的移植明顯促進(jìn)裸鼠頸動(dòng)脈損傷再內(nèi)皮化的面積。對(duì)比在靜態(tài)條件的EPCs，經(jīng)過切應(yīng)力處理后移植的EPCs具有更大范圍的再內(nèi)皮化表現(xiàn)，說明切應(yīng)力能夠促進(jìn)EPCs體內(nèi)再內(nèi)皮化能力（n=6，P<0.05）。

3討論

大量研究表明，切應(yīng)力在調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能起到重要的作用，表明了切應(yīng)力是一個(gè)非藥理學(xué)手段，但又是調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞功能極其重要的方法[3-4]。然而，目前尚不清楚切應(yīng)力是否能提高內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及提高血管再內(nèi)皮化能力。因此我們假設(shè)切應(yīng)力誘導(dǎo)增加內(nèi)皮祖細(xì)胞功能可能能夠促進(jìn)體內(nèi)內(nèi)皮祖細(xì)胞再內(nèi)皮化能力。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，我們首次研究切應(yīng)力對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外遷移，黏附和增殖能力的作用。

本研究表明，切應(yīng)力能夠提高體外內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、黏附以及增殖功能，并呈劑量依賴性改變。同時(shí)，相比較于沒有切應(yīng)力處理的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組切應(yīng)力能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)頸動(dòng)脈損傷后血管再內(nèi)皮化能力及范圍，提示了切應(yīng)力是改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能和活性并且利于血管保護(hù)的因素之一。然而，切應(yīng)力對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及相關(guān)的再內(nèi)皮化的具體分子機(jī)制還不明確，仍需更進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果對(duì)以內(nèi)皮祖細(xì)胞作為防治心血管疾病為基礎(chǔ)的治療方法提供了新的角度，以往采取藥物對(duì)血管損傷干預(yù)等方法較多，而非藥理學(xué)手段如切應(yīng)力介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)血管損傷疾病進(jìn)行治療的報(bào)道少之又少。因此，通過切應(yīng)力改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能以及上調(diào)血管損傷部位再內(nèi)皮化能力，對(duì)于今后防治心血管疾病有巨大潛在的臨床價(jià)值。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)切應(yīng)力可改善內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能活性，是以內(nèi)皮祖細(xì)胞為基礎(chǔ)的修復(fù)血管內(nèi)皮損傷的重要手段。

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編輯/申磊