王 婷,孫紅文,毛洪鈞 (南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300071)

熒光示蹤技術(shù)對(duì)土壤中誘變菌的生長(zhǎng)研究

王 婷,孫紅文*,毛洪鈞 (南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300071)

采用熒光染料DAPI(4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole)對(duì)外源微生物Bacillus subtilis 38(B38)的DNA分子進(jìn)行標(biāo)記,利用熒光示蹤技術(shù)對(duì)外源微生物的生長(zhǎng)繁殖進(jìn)行有效監(jiān)測(cè).通過(guò)篩選DAPI 工作液的使用濃度與菌懸液的稀釋比例,得出采用0.1 μg/mL濃度的DAPI對(duì)稀釋106倍的菌懸液進(jìn)行染色,熒光信號(hào)強(qiáng)度適宜,菌體分散度良好,可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確計(jì)數(shù).采用上述染色條件,對(duì)60d內(nèi)土壤B38菌體數(shù)量的變化進(jìn)行階段性監(jiān)測(cè).結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種后菌體濃度顯著增加,平衡后菌體濃度達(dá)到(1.05±0.01)×1010cells/mL,與初期施加量相比,增長(zhǎng)量達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí).以上結(jié)果表明,采用DAPI染料對(duì)外源微生物進(jìn)行熒光示蹤計(jì)數(shù),為監(jiān)測(cè)外源微生物的生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)提供了一種簡(jiǎn)便、有效的方法.

熒光標(biāo)記；熒光計(jì)數(shù)；DAPI；細(xì)菌；土壤

生物強(qiáng)化技術(shù)作為土壤重金屬污染的一種原位修復(fù)手段,近年來(lái)成為環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)

[1-2].接種到土壤中的外源微生物需要適應(yīng)新的環(huán)境條件,并且外源微生物與土著微生物之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)作用,引入的外源微生物能否在土壤中得到正常的生長(zhǎng)繁殖、發(fā)揮其最大活性決定著生物強(qiáng)化技術(shù)實(shí)施的成敗[3],因此有必要對(duì)外源微生物的生長(zhǎng)繁殖情況進(jìn)行跟蹤調(diào)查.

目前,對(duì)土壤微生物計(jì)數(shù)的研究方法主要有傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離法[4],放射性同位素標(biāo)記法[5-6],穩(wěn)定同位素標(biāo)記法[7-8]和熒光標(biāo)記示蹤法[9-11].

近年來(lái),一些學(xué)者致力于土壤中微生物的靶向示蹤研究.錢(qián)明媚等[12]采用穩(wěn)定性同位素方法,以13C標(biāo)記了自養(yǎng)固碳微生物的cbbLR基因,利用分子生物學(xué)手段分析標(biāo)記后的 cbbLR基因多樣性,從而揭示了自養(yǎng)固碳微生物在免耕水稻土中的豐度和多樣性. Kinsella等[13]將放射性同位素 2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖(18FDG)標(biāo)記的拉恩菌加入模擬的酸化礦質(zhì)土壤中,利用正電子發(fā)射斷層成像技術(shù)(PET)對(duì)標(biāo)記后的微生物進(jìn)行放射性成像分析,以對(duì)微生物的地下活動(dòng)情況進(jìn)行原位監(jiān)測(cè).鮑林林等[14]選擇氨單加氧酶基因(amoA)作為分子標(biāo)記物,通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)標(biāo)記的基因進(jìn)行克隆和測(cè)序,以跟蹤北運(yùn)河表層沉積物中的氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌的群落多樣性、豐度、系統(tǒng)發(fā)育及其與環(huán)境因子的響應(yīng)關(guān)系.

但是放射性同位素標(biāo)記法中使用的放射性同位素不可避免的會(huì)給待測(cè)微生物造成損害,影響微生物正常的傳代,影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性.此外,放射性同位素標(biāo)記試劑具有放射性,會(huì)造成環(huán)境污染,且通常需要復(fù)雜的放化設(shè)備及防輻射防護(hù)措施,因此在實(shí)際土壤的修復(fù)中應(yīng)用存在局限性.而穩(wěn)定同位素標(biāo)記法中用到的穩(wěn)定同位素試劑為高技術(shù)含量、高附加值的高端科研用試劑,存在國(guó)外試劑壟斷國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的局面[15].此外,生物標(biāo)記物的定量測(cè)定需要借助色譜、質(zhì)譜等大型儀器[8,16].因此,該技術(shù)存在成本高、方法復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn).

熒光染色法分為熒光免疫染色法和熒光染料染色法.熒光染料主要分為2大類:一類不能夠透過(guò)活細(xì)胞膜,僅能夠?qū)潭ǖ募?xì)胞和細(xì)胞膜有破損的細(xì)胞核進(jìn)行染色的染料,例如碘化丙啶(PI)[17]和溴化乙錠(EB)[18]等;另一類能夠透過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行染色,例如羧基二乙酸熒光素(CFDA)[19]、羅丹明123(Rh123)[20]、4’, 6’-二脒基-2-苯基吲(DAPI)[21]等;顯然,后者更有可能在保持外源微生物的活性的前提下進(jìn)行熒光標(biāo)記.其中DAPI與DNA結(jié)合之后,熒光強(qiáng)度比結(jié)合之前增加了近25倍[21].此外,DAPI可以穿透完整的細(xì)胞膜,與 DNA分子穩(wěn)定結(jié)合,因此不僅可以對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行染色,還可以用于活細(xì)胞的染色.

1976年,Williamson等[22]首先將DAPI用作DNA 熒光染料,成功的用于觀測(cè)酵母菌的線粒體DNA.之后Lin等[23]將DAPI用于檢測(cè)姊妹染色體的交換,并應(yīng)用到染色體顯帶技術(shù)上[21].后來(lái)許多研究者使用 DAPI來(lái)研究原核生物的DNA和真核生物的細(xì)胞核以及核外DNA.DAPI比其他的熒光染料具備以下優(yōu)點(diǎn):采用直接染色法,操作方便快速;靈敏度非常高,能檢測(cè)到 2× 10-4pg DNA;使用量非常少,通常不超過(guò) 0.5μg/ mL;穩(wěn)定性好,熒光衰退期要低于其他染料.

近年來(lái),DAPI 被引入微生物生態(tài)學(xué)的研究,在熒光原位雜交技術(shù)中,用 DAPI 對(duì)微生物的DNA 進(jìn)行標(biāo)記,較多的應(yīng)用于污水處理系統(tǒng)或土壤等樣品的微生物總量估計(jì)[24-25].例如,陳琛等

[26]使用 DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法測(cè)量了感潮河段沉積物中的細(xì)菌數(shù)量,通過(guò)調(diào)整染料濃度、染色時(shí)間等影響因素,成功對(duì)沉積物中的細(xì)菌總量進(jìn)行了計(jì)數(shù).但是將其應(yīng)用于單一外源微生物的靶向定位示蹤的研究甚少.

為實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤修復(fù)過(guò)程中所加入的單一外源微生物的生長(zhǎng)繁殖情況進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)的目的,本論文創(chuàng)新性的引入熒光示蹤技術(shù).使用熒光染料DAPI對(duì)誘變菌的DNA 進(jìn)行標(biāo)記,與微生物載體諾沃肥復(fù)合后,接種于受污染土壤.通過(guò)篩選DAPI 染料的使用濃度與菌懸液的稀釋比例,采用熒光計(jì)數(shù)技術(shù),成功的實(shí)現(xiàn)對(duì)外源微生物在土壤中的生長(zhǎng)繁殖情況的跟蹤研究.為外源微生物生長(zhǎng)繁殖的定量化研究提供了一種簡(jiǎn)便、快捷的方法,保證生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)的順利實(shí)施.

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及溶液的配制

使用液體牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)活性菌株B38進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)基的配制方法為:準(zhǔn)確稱取蛋白胨 10g/L,氯化鈉 5g/L,牛肉膏5g/L,用 1mol/L的鹽酸和 1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH=7.2,于121

℃高壓蒸汽滅菌30min備用.

0.85 %(M/V)生理鹽水的配制:準(zhǔn)確稱取0.85g氯化鈉,溶解后用蒸餾水稀釋至 100mL,于121℃下高壓滅菌30min備用.

DAPI 儲(chǔ)備液的配制:用雙蒸水將 DAPI 粉末配制成 1.0×103μg/mL的儲(chǔ)備液,于-20℃保存?zhèn)溆?

DAPI工作液的配制:用磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)分別稀釋儲(chǔ)備液至 10μg/mL、0.1μg/mL,制得DAPI工作液,于4℃保存?zhèn)溆肹27].

1.2 菌種的培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中用到的誘變菌種 B38為實(shí)驗(yàn)室前期以枯草芽孢桿菌為初始菌種,通過(guò)紫外誘變5min得到的高效鎘耐受性的誘變菌種[28].出發(fā)菌枯草芽孢桿菌購(gòu)買自國(guó)家普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC).出發(fā)菌株對(duì)鎘有一定的抗性,其最小抑制濃度(MIC)為 0.25mmol/L,而選育出的 B38菌種,其抗鎘性能大大提高,MIC達(dá)到了3mmol/L[29].

將B38菌體接種于5mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,于37℃,150r/min活化培養(yǎng)10h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中段;之后取 1mL菌懸液接種于 100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,于37℃,150r/min擴(kuò)大培養(yǎng).每隔 2h,利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的OD600值,并同時(shí)對(duì)菌懸液進(jìn)行顯微計(jì)數(shù),測(cè)定B38的生長(zhǎng)曲線[29].每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行.

1.3 DAPI染料對(duì)誘變菌的熒光染色方法

挑取一環(huán)B38誘變菌接種于5mL液體牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中,于 35℃,150r/min下活化培養(yǎng)10h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中段.取1mL活化的B38菌懸液,接種于100mL液體牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基,于35℃,150r/min,擴(kuò)大培養(yǎng)10h.

取10mL菌懸液,9000r/min離心10min,棄去上清液,用滅菌的 0.85%生理鹽水重新懸浮菌體.加入37%的甲醛溶液固定B38細(xì)胞.

各取2mL固定后的菌懸液,分別加入0.2mL,濃度為1.0×103μg/mL、10μg/mL和0.1μg/mL的DAPI熒光染料,避光染色15min.

分別將染色的菌懸液用 0.85%的生理鹽水稀釋至104和106倍使用.用0.22μm的黑色核孔濾膜過(guò)濾染色后的菌懸液,用 0.85%的生理鹽水洗滌 6次,以洗去多余的染料.用 1:1的甘油和PBS試劑配制封片劑,將核孔膜置于載玻片上,封片,用熒光顯微鏡在紫外下觀察細(xì)菌染色情況[25].以未熒光標(biāo)記的菌體作為對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3個(gè)平行.

1.4 熒光標(biāo)記誘變菌在液體培養(yǎng)基中的傳代實(shí)驗(yàn)

挑取一環(huán)B38誘變菌接種于5mL液體牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中,35℃,150r/min下活化培養(yǎng)10h.取1mL活化的菌懸液,接種于100mL液體牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中.于 35℃,150r/min,擴(kuò)大培養(yǎng)10h.

取10mL 菌懸液,3000r/min離心10min,棄去上清液,用滅菌的 0.85%生理鹽水重新懸浮菌體.在2mL 菌懸液中加入通過(guò)熒光染色實(shí)驗(yàn)確定濃度的DAPI 熒光染料,避光染色15min.用0.85%的生理鹽水洗滌 6 次,以洗去多余的染料.取1mL菌懸液接種至 100mL液體牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基,傳代培養(yǎng)10h.

提取10mL菌懸液,稀釋至適當(dāng)濃度.取2mL菌懸液用 0.22μm的黑色核孔濾膜過(guò)濾,將核孔膜置于載玻片上,封片,用熒光顯微鏡在紫外下觀察計(jì)數(shù).以未經(jīng)熒光標(biāo)記的菌體作為對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行.

1.5 熒光標(biāo)記誘變菌的土壤熒光示蹤方法

采集天津市津南區(qū)污水灌溉多年的蔬菜農(nóng)田土壤0～20cm表層土,風(fēng)干后過(guò)2mm篩.其理化性質(zhì)見(jiàn)表1.

表1 供試土壤的理化性質(zhì)與重金屬背景含量Table 1 Properties and heavy metal concentrations of the tested soils

挑取一環(huán)B38 誘變菌接種于5mL液體牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中,35℃,150r/min下活化培養(yǎng)10h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中段.取1mL活化的B38菌懸液,接種于 100mL液體牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基.于35℃,150r/min,擴(kuò)大培養(yǎng) 10h.取 10mL菌懸液,在3000r/min下,離心 10min,棄去上清液,用滅菌的0.85%生理鹽水重新懸浮菌體.取 2mL菌懸液,加入選定濃度的 DAPI熒光染料,避光染色 15min.用0.85%的生理鹽水洗滌6次,以洗去多余的染料.

微生物載體諾沃肥取自天津市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)諾維信?(中國(guó))生物技術(shù)有限公司.將諾沃肥風(fēng)干后磨碎,過(guò)2mm篩備用.

選擇諾沃肥與土壤的質(zhì)量比為2%的施用量,以20mL/kg的接種量(即2%的施用水平)將熒光標(biāo)記的 B38菌懸液與微生物載體充分接觸制備成改良劑,繼而與土壤(800g)充分混合均勻后于人工氣候箱中培養(yǎng),溫度控制在 25±1℃,光周期為12:12,定期澆水以保持一定的土壤濕度.

培養(yǎng)第 1、5、10、20、30、60d采集 0.5g土壤樣品,加入 10mL生理鹽水于室溫下 200r/ min振蕩15min以提取土壤中的微生物.取10mL提取液,稀釋后取2mL菌懸液用0.22μm的黑色核孔濾膜過(guò)濾,將核孔膜置于載玻片上,封片,用熒光顯微鏡在紫外下觀察計(jì)數(shù).土壤微生物數(shù)量的計(jì)算方法為,將計(jì)數(shù)所得數(shù)量轉(zhuǎn)換為每克干土所含微生物數(shù)(cells/g).以未經(jīng)熒光標(biāo)記的菌體作為對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行.各組處理見(jiàn)表2.

表2 分組設(shè)置Table 2 Treatments with different amendments designed in the experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 誘變菌B38的生長(zhǎng)曲線

圖1 B38菌種的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of B38 species

誘變菌B38的生長(zhǎng)曲線如圖1所示.B38的生長(zhǎng)繁殖分為4個(gè)階段:調(diào)整期(1)、對(duì)數(shù)期(2)、穩(wěn)定期(3)和衰亡期(4).B38在 2h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此階段菌體快速生長(zhǎng),生物量迅速增加;12h后,菌體進(jìn)入穩(wěn)定期,活菌數(shù)曲線和渾濁度曲線同時(shí)達(dá)到峰值.處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后段的菌株具有較高的生理活性,因此,選擇培養(yǎng)時(shí)間為10h,即培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后段的菌懸液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

將12h以內(nèi)的活菌數(shù)與菌懸液的OD600值進(jìn)行線性回歸,擬合結(jié)果見(jiàn)圖 2.從接種期至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束,活菌數(shù)與菌懸液的 OD600值之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r2=0.9766),因而在后續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,采用測(cè)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B38菌懸液OD600值的方法,通過(guò)線性回歸計(jì)算對(duì)細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù),這一發(fā)現(xiàn)可顯著提高實(shí)驗(yàn)效率.

圖2 活菌數(shù)與菌懸液的OD600值之間的線性關(guān)系Fig.2 The linear regression of biomass concentration versus OD600

2.2 DAPI對(duì)誘變菌B38的熒光染色結(jié)果

DAPI對(duì)誘變菌B38的熒光染色結(jié)果見(jiàn)圖3.圖3a為未染色的B38菌體(對(duì)照組),在紫外光下觀察不到熒光反應(yīng),因此排除了菌體自發(fā)光對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾.為探索適宜的DAPI染料濃度,選擇不同濃度梯度的 DAPI儲(chǔ)備液和工作液進(jìn)行熒光染色實(shí)驗(yàn).圖 3b為使用 1.0×103μg/mL的 DAPI儲(chǔ)備液對(duì) B38菌體進(jìn)行染色的結(jié)果,可見(jiàn) DAPI對(duì)B38染色成功,但是視野中熒光反應(yīng)過(guò)強(qiáng),因而判斷染料濃度過(guò)高.繼而稀釋儲(chǔ)備液,使用濃度為10μg/mL的 DAPI工作液進(jìn)行染色,結(jié)果熒光反應(yīng)仍然過(guò)強(qiáng),無(wú)法識(shí)別菌株個(gè)體,因此需對(duì) DAPI工作液進(jìn)一步進(jìn)行稀釋(圖3c).圖4d為使用濃度為0.1μg/mL的DAPI工作液進(jìn)行染色的結(jié)果,視野中熒光反應(yīng)強(qiáng)度適中,但濾膜上可觀察到一定厚度的藍(lán)色菌膜,這是由于菌體濃度過(guò)高導(dǎo)致,為進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)需對(duì)菌懸液進(jìn)行稀釋.嘗試將菌懸液稀釋 104倍(圖 3e),菌膜消失,但是菌體仍呈現(xiàn)團(tuán)聚狀態(tài),無(wú)法對(duì)個(gè)體進(jìn)行識(shí)別和準(zhǔn)確計(jì)數(shù),因此進(jìn)一步將菌懸液稀釋至106倍(圖3f),如圖可見(jiàn)菌體分散度良好,且熒光反應(yīng)強(qiáng)度適宜,可進(jìn)行計(jì)數(shù)分析.因此,選擇0.1μg/mL 的DAPI染料濃度、菌懸液稀釋106倍進(jìn)行后續(xù)研究.

圖3 誘變菌B38的熒光染色結(jié)果(×50)Fig.3 B38cells stained with DAPI (×50)

2.3 熒光標(biāo)記誘變菌在液體培養(yǎng)基中的傳代研究

使用濃度為0.1μg/mL的DAPI染料對(duì)菌懸液進(jìn)行染色,稀釋 106倍后進(jìn)行熒光顯微計(jì)數(shù),得到菌懸液濃度為(3.21±0.22)×108cells/mL.根據(jù)菌體計(jì)數(shù)與菌懸液的OD600值線性關(guān)系方程(圖2),由菌懸液的 OD600值計(jì)算得到擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌懸液濃度為(4.92±0.15)×108cells/mL.熒光計(jì)數(shù)濃度與理論濃度吻合,因而 DAPI熒光染色顯微計(jì)數(shù)方法可用于對(duì)B38菌體的計(jì)數(shù)研究.

對(duì)傳代培養(yǎng) 10h 后的菌懸液進(jìn)行熒光顯微計(jì)數(shù),所得菌體濃度為(5.58±0.13)×108cells/mL,查找 B38 生長(zhǎng)曲線(圖 2),該菌體濃度符合 10h培養(yǎng)應(yīng)有的濃度.因此,熒光特性成功的在B38傳代過(guò)程中得以保持,計(jì)數(shù)準(zhǔn)確有效,DAPI熒光染色顯微計(jì)數(shù)方法對(duì)于B38的傳代示蹤研究可行.

2.4 熒光標(biāo)記誘變菌在土壤中數(shù)量隨時(shí)間的變化

使用的菌懸液初始接種濃度為(5.58±0.13)× 108cells/mL,以 2%的接種量接種于土壤中,計(jì)算得到土壤中 B38 初始濃度為(1.12±0.03)× 107cells/g.

圖4 誘變菌B38在土壤中的熒光標(biāo)記示蹤結(jié)果(S0:對(duì)照;SB:僅添加熒光標(biāo)記的B38;SNB:同時(shí)添加諾沃肥和熒光標(biāo)記的B38)Fig. 4 Concentrations of fluorescence labeled B38 strain in soil samples under different treatments (S0: control; SB: soil amended with labeled B38; SNB: soil amended with NG and labeled B38)

采集第1、5、10、20、30、60d的土壤樣品對(duì)B38誘變菌進(jìn)行熒光計(jì)數(shù),結(jié)果見(jiàn)圖4.添加未進(jìn)行熒光標(biāo)記 B38 菌體的對(duì)照組(S0)未觀察到熒光反應(yīng),這就同時(shí)排除了土著微生物自發(fā)光對(duì)熒光計(jì)數(shù)的干擾.僅添加熒光標(biāo)記的 B38(SB),土壤B38 菌體濃度呈不斷上升的狀態(tài),30d 后達(dá)到平衡,直到 60d 菌體濃度仍維持穩(wěn)定水平,濃度達(dá)到(3.02±0.09)×108cells/g,以20mL/kg的接種量換算,可得濃度相當(dāng)于(1.51±0.004)×1010cells/mL,與初始接種量相比,濃度增加了超過(guò)3個(gè)數(shù)量級(jí).諾沃肥與標(biāo)記的 B38復(fù)合的一組(SNB),自施加后菌體濃度迅速上升,1d之后即迅速達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)并可以保持至 60d,最終濃度為(2.09±0.28)× 108cells/g,以20mL/kg的接種量換算,可得濃度相當(dāng)于(1.05±0.01)×1010cells/mL,與初始接種量相比,濃度提高了近3個(gè)數(shù)量級(jí).

熒光示蹤第 60d的各組處理土壤樣品 B38標(biāo)記菌的熒光成像結(jié)果見(jiàn)圖 5.添加未進(jìn)行熒光標(biāo)記的B38菌體的對(duì)照組觀察不到熒光反應(yīng),外源微生物 B38和土著微生物都不存在自發(fā)光現(xiàn)象,對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果不存在干擾影響.僅添加熒光標(biāo)記的B38的一組(SB),鏡檢下土壤中B38菌體濃度最高.諾沃肥與標(biāo)記的B38復(fù)合的一組(SNB),標(biāo)記菌濃度反而低于SB組處理.

前期使用 DNA擴(kuò)增-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)對(duì)各組處理土壤總的微生物豐度進(jìn)行研究,與對(duì)照相比,僅添加 B38的處理(SB)土壤微生物多樣性并沒(méi)有明顯改善,而加入諾沃肥后(SNB)土壤總的微生物豐度顯著提高

[30].結(jié)合本文針對(duì)外源微生物B38的DAPI熒光計(jì)數(shù)結(jié)果可見(jiàn),B38作為一株在高濃度鎘脅迫下通過(guò)紫外誘變獲得的高效重金屬耐受菌株,與土著微生物相比,對(duì)高污染、低肥力的惡劣環(huán)境條件有著較高的適應(yīng)性及發(fā)展?jié)摿?在與土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)中取得明顯的優(yōu)勢(shì).載體諾沃肥含有較高的有機(jī)質(zhì)含量(91.8%)與陽(yáng)離子交換容量(107.8cmol/kg),可為土壤微生物提供碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[30],因此,添加諾沃肥后,土壤肥力得到提高,環(huán)境條件的改善使得土著微生物得以生長(zhǎng)繁殖,這就使得土著微生物開(kāi)始對(duì)外源微生物B38的生長(zhǎng)造成競(jìng)爭(zhēng)性抑制,因此SNB處理下的B38菌體濃度反而低于SB的處理.但是,在達(dá)到平衡后,SNB處理下B38的生物量與初期施加量相比增加至近 3個(gè)數(shù)量級(jí)(圖 4),參考生長(zhǎng)曲線(圖 1),B38對(duì)數(shù)期的菌體濃度峰值((8.38±0.12)× 108cells/mL)與初期接種量((1.56±0.08)×106cells/ mL)相比翻倍達(dá)到近3個(gè)數(shù)量級(jí),因此,B38投加到受污染的土壤中后生長(zhǎng)繁殖狀況良好.這說(shuō)明在生物強(qiáng)化處理技術(shù)的實(shí)施過(guò)程中,外源微生物B38的活性得到了保持與發(fā)揮,這就保證了投加外源微生物可以按照所預(yù)期的思路加速生物修復(fù)進(jìn)程.

圖5 不同處理下誘變菌B38 60d熒光照相結(jié)果(×50)Fig.5 Fluorescence microscopy of the cells of fluorescence labeled B38 strain at 60d under different treatments

3 結(jié)論

3.1 為研究土壤中施加外源微生物B38后,其菌體濃度隨時(shí)間的變化情況,本文創(chuàng)新性的引入了DAPI熒光染色技術(shù)標(biāo)記微生物的DNA分子進(jìn)行顯微熒光示蹤計(jì)數(shù)研究.選擇不同濃度梯度的染料進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示使用高濃度的工作液鏡檢下熒光反應(yīng)過(guò)強(qiáng),無(wú)法識(shí)別單個(gè)菌體,最終選擇0.1μg/mL的DAPI為最適濃度.

3.2 為能夠?qū)w數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù),選擇不同稀釋倍數(shù)進(jìn)行鏡檢.結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌懸液稀釋 106倍后,菌體分散度高、數(shù)量適中,可實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù).使用熒光顯微計(jì)數(shù)得到的 B38 菌體濃度為(3.21± 0.22)×108cells/mL,使用OD600值換算得到的濃度為(4.92±0.15)×108cells/mL,二者達(dá)到高度一致,因此熒光染色顯微計(jì)數(shù)方法準(zhǔn)確可行.

3.3 將標(biāo)記后的B38加入土壤中,傳代培養(yǎng)10h后,提取土壤微生物懸液對(duì)B38菌體進(jìn)行熒光計(jì)數(shù),所得菌體濃度為(5.58±0.13)×108cells/mL,符合B38的生長(zhǎng)曲線.因此經(jīng)過(guò)標(biāo)記的外源微生物的熒光特性在傳代過(guò)程中得到了良好的保持.

3.4 在60d的時(shí)間內(nèi)跟蹤外源微生物B38在實(shí)際土壤修復(fù)過(guò)程中的數(shù)量變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)B38對(duì)惡劣的環(huán)境有較高的適應(yīng)性和發(fā)展?jié)摿?在添加了微生物載體后,由于載體物質(zhì)為土著微生物和外源微生物同時(shí)提供碳源、氮源及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),此時(shí),土著微生物對(duì)B38的生長(zhǎng)繁殖起到了部分競(jìng)爭(zhēng)抑制作用,但是 B38菌體濃度仍達(dá)到(1.05±0.01)×1010cells/mL,與初期施加量相比,提高了近3個(gè)數(shù)量級(jí),外源微生物得到了良好的生長(zhǎng)繁殖.

[1] Tyagi M, Fonseca M M R D, Carvalho C C C R D. Bioaugmentation and biostimulation strategies to improve the effectiveness of bioremediation processes [J]. Biodegradation, 2011,22(2):231-241.

[2] Bento F M, Camargo F A O, Okeke B C, et al. Comparative bioremediation of soils contaminated with diesel oil by natural attenuation, biostimulation and bioaugmentation [J]. Bioresource Technology, 2005,96(9):1049-1055.

[3] Bouchez T, Patureau D, Dabert P, et al. Ecological study of a bioaugmentation failure [J]. Environmental Mcrobiology, 2000, 2:179-190.

[4] Kirk J L, Beaudette L A, Hart M, et al. Methods of studying soil microbial diversity [J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 58:169-188.

[5] B??th E. Thymidine incorporation into soil bacteria [J]. Soil Biology & Biochemistry, 1990,22(6):803–810.

[6] Harris D, Paul E A. Measurement of bacterial growth rates in soil [J]. Applied Soil Ecology, 1994,1(4):277–290.

[7] Zhang C L. Stable carbon isotopes of lipid biomarkers: analysis of metabolites and metabolic fates of environmental microorganisms [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13(1):25-30.

[8] Bull I D, Parekh N R, Hall G H, et al. Detection and classification of atmospheric methane oxidizing bacteria in soil [J]. Nature, 2000,405:175-178.

[9] Roberts P M, Goldfarb D S. In vivo nuclear transport kinetics in Saccharomyces cerevisiae [J]. Methods in Cell Biology, 1997, 53:545-557.

[10] Morono Y, Takano S, Miyanaga K, et al. Application of glutaraldehyde for the staining of esterase-active cells with carboxyfluorescein diacetate [J]. Biotechnology Letters, 2004, 26:379-383.

[11] Miyanokurosaki N, Barnor J S, Takeuchi H, et al. In vitro and in vivo transport and delivery of phosphorothioate oligonucleotides with cationic liposomes [J]. Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2004,15:87-94.

[12] 錢(qián)明媚,肖永良,彭文濤,等.免耕水稻土固定 CO2自養(yǎng)微生物多樣性 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(12):3754-3761.

[13] Kinsella K, Schlyer D J, Fowler J S, et al. Evaluation of positron emission tomography as a method to visualize subsurface microbial processes [J]. Journal of Hazardous Materials, 2012, 213–214(3):498-501.

[14] 鮑林林,陳永娟,王曉燕.北運(yùn)河沉積物中氨氧化微生物的群落特征 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(1):179-189.

[15] 杜曉寧,王 偉,雷 雯.穩(wěn)定性同位素標(biāo)記試劑的研發(fā)及應(yīng)用展望 [J]. 化學(xué)試劑, 2015,37(9):769-775.

[16] Boschker H T S, Nold S C, Wellsbury, et al. Direct linking of microbial populations to specific biogeochemical processes by13C-labelling of biomarkers [J]. Nature, 1998,392:801-805.

[17] Ling E, Shirai K, Kanekatsy R, et al. Classification of larval circulating hemocytes of the silkworm, Bombyx mori, by acridine orange and propidium iodide staining [J]. Histochemistry and Cell Biology, 2003,120:505-511.

[18] Alzola E, Chaib N, Pochet S, et al. Modulation by propranolol of the uptake of ethidium bromide by rat submandibular acinar cells exposed to a P2X7agonist or to maitotoxin [J]. Cellular Signaling, 2001,13:465-473.

[19] Fukunaga S, Jintoku T, Iwata Y, et al. Investigation of microorganisms in bentonite deposits [J]. Geomicrobiology Journal, 2005,22:361-370.

[20] Lugo M R, Sharom F J. Interaction of LDS-751with P-glycoprotein and mapping of the location of the R drug binding site [J]. Biochemistry, 2005,44:643-655.

[21] Lin M, Comings D, Alfi O. Optical studies of the interaction ofcounting aquatic microflora1 [J]. Limnology and Oceanography, 1980:25:943-948.

[28] Jiang C, Sun H, Sun T, et al. Immobilization of cadmium in soils by UV-mutated Bacillus subtilis 38bioaugmentation and Novo Gro amendment [J]. Journal of Hazardous Materials, 2009,167: 1170-1177.

[29] Chen H, Yao J, Wang F, et al. Toxicity of three phenolic compounds and their mixtures on the gram-positive bacteria Bacillus subtilis in the aquatic environment [J]. Science of the Total Environment, 2010,408:1043-1049.

[30] Wang T, Sun H, Mao H, et al. The immobilization of heavy metals in soil by bioaugmentation of a UV-mutant Bacillus subtilis 38assisted by NovoGro biostimulation and changes of soil microbial community [J]. Journal of Hazardous Materials, 2014,278:483-490.

[22] Willamson D, Fennell D. The use of fluorescent DNA-binding agent for detecting and separating yeast mitochondrial DNA [J]. Methods in Cell Biology, 1976,12:335-351.

[23] Lin M, Alfi O. Detection of sister chromatid exchanges by 4′-6′-diamidino-2-phenylindole fluorescence [J]. Chromosoma, 1976,57:219-225.

[24] Rogers S W, Ong S K, Moorman T B. Mineralization of PAHs in coal–tar impacted aquifer sediments and associated microbial community structure investigated with FISH [J]. Chemosphere, 2007,69:1563-1573.

[25] Lozada M, Itaria R F, Figuerola E L, et al. Bacterial community shifts in nonylphenol polyethoxylates-enriched activated sludge [J]. Water Research, 2004,38:2077-2086.

[26] 陳 琛,黃 珊,吳群河,等.DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法的感潮河段沉積物細(xì)菌數(shù)量測(cè)量影響因素研究 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2010,31(8): 1918-1925.

[27] Porter K G, Feig Y S. The use of DAPI for identifying and

Investigation of growth in a UV-mutant species in soil using fluorescent tracing technique.

WANG Ting, SUN Hong-wen*, MAO Hong-jun
(College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：328～335

The DNA molecular of the exotic microorganism Bacillus subtilis 38 (B38, a mutant species of Bacillus subtilis) was used labelled by a fluorescent dye, DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole), to monitor the microorganism growth during the process of soil remediation by bioaugmentation technique. By optimizing the DAPI concentration and the dilution ratio of the bacterial suspension, an ideal DAPI concentrations of 0.1 μg/mL and a bacterial suspension dilution fold of 106were applied, and the appropriate fluorescence intensity and cell dispersity for the accurate fluorescent dot counting were obtained. The quantitative changes of B38 in 60 days soil remediation was monitored under the optimized conditions. The results showed that the numbers of B38 in soil increased obviously, and then reached an equilibrium concentration of (1.05±0.01)×1010cells/mL. The equilibrium concentration was as high as 3orders of magnitude of the initial dosage. Thus, DAPI labelled fluorescent tracing technique was a convenient and effective approach to monitor the growth and reproduction of exotic microorganism.

fluorescent labeling；fluorescent counting；DAPI；bacterium；soil

X53

A

1000-6923(2017)01-0328-08

王 婷(1985-),女,天津人,講師,博士,主要從事土壤重金屬污染修復(fù)研究.發(fā)表論文10余篇. 4′-6-diamidino-2-phenylindole with DNA and metaphase chromosomes [J]. Chromosoma, 1977,60:15-25.

2016-03-25

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(青年項(xiàng)目) (15JCQNJC15200);國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAC23B0205)

* 責(zé)任作者, 教授, sunhongwen@nankai.edu.cn