董 梅， 程樹(shù)彬， 郭彥芳， 李 釗， 李世平， 張祥建， 李春巖

器官型腦片培養(yǎng)OGD復(fù)氧復(fù)糖模型中丁苯酞對(duì)于bcl-2/bax、及bim蛋白的調(diào)節(jié)作用

董 梅1， 程樹(shù)彬2， 郭彥芳3， 李 釗4， 李世平1， 張祥建1， 李春巖1

目的 觀察正丁基苯酞(NBP)對(duì)乳大鼠大腦皮質(zhì)器官型腦片的氧糖剝奪模型(OGD)中細(xì)胞凋亡bcl-2、bax及bim蛋白的調(diào)節(jié)作用。方法 用生后7 d的SD乳大鼠制備大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)器官型腦片，將培養(yǎng)2 w的腦片隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、模型組(M組)、溶劑對(duì)照組(Sc組)和實(shí)驗(yàn)組(T組)，T組在OGD干預(yù)30 min后給予NBP 10μM。將腦片制備OGD模型30 min，部分腦片在NBP干預(yù)前后不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、1 h、24 h、72 h)進(jìn)行PI染色；部分腦片在NBP干預(yù)后6 h用戊二醛固定，做石蠟切片，行HE染色及bcl-2、bax、bim免疫組化染色。結(jié)果 PI染色可見(jiàn)C組在不同時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，M組、Sc組和T組熒光強(qiáng)度均隨時(shí)間有不同程度增強(qiáng)，M組和Sc組各時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異，T組熒光強(qiáng)度較前兩者降低，隨時(shí)間延長(zhǎng)，降低幅度增大，尤其是72 h時(shí)間點(diǎn)。HE染色C組可見(jiàn)皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)特有的大錐體細(xì)胞，結(jié)構(gòu)清晰，M組和T組可見(jiàn)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核溶解，M組相對(duì)明顯。免疫組化染色可見(jiàn)在3種染色中M組和T組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較C組增多，其中bcl-2染色中T組陽(yáng)性細(xì)胞增多更明顯，bax和bim染色中M組陽(yáng)性細(xì)胞增多更明顯，3種染色中C、M、T各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 NBP對(duì)OGD后的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，可能是通過(guò)對(duì)bcl-2、bax以及bim蛋白的調(diào)節(jié)減少細(xì)胞凋亡。

器官型腦片； OGD； 丁苯酞； 細(xì)胞凋亡； bcl-2； bax； bim

研究表明缺血半暗帶中的許多細(xì)胞在卒中后的幾小時(shí)至幾天中可能會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。相比于細(xì)胞壞死，細(xì)胞凋亡是能量依賴的程序性的細(xì)胞死亡[1]。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡中起重要的作用，包括以bcl-2蛋白為代表的抗凋亡蛋白，以bax、bak為代表的促凋亡蛋白和以bim、bik為代表的促凋亡蛋白。Bcl-2、bax、bim在細(xì)胞凋亡中均發(fā)揮重要作用，如果可以在細(xì)胞凋亡早期對(duì)這些蛋白表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，則可抑制細(xì)胞凋亡，挽救細(xì)胞。

丁苯酞(dl-3n-butylphthalide，NBP)是我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)家一類新藥，它能夠從多個(gè)環(huán)節(jié)改善腦缺血性損傷，對(duì)缺血性卒中具有較佳的治療作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)NBP對(duì)缺血損傷后線粒體具有保護(hù)作用[2，3]。而線粒體在細(xì)胞凋亡的發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)器官型腦片培養(yǎng)氧糖剝奪模型(oxygen and glucose deprivation，OGD)復(fù)糖復(fù)氧后NBP的干預(yù)，觀察NBP對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，并觀察其對(duì)bcl-2、bax、bim蛋白的影響，探討NBP的抗凋亡作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用出生后5～7 d的SD乳鼠(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Mcilwain活組織切片機(jī)、CO2培養(yǎng)箱(Sanyo，MCO-18AIC)、插入式培養(yǎng)皿Millicell-CM insert(Millipore)，厭氧罐，空氣真空泵(天津奧特塞恩斯儀器有限公司，AP-01D)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 正常培養(yǎng)液(50%MEM+25%馬血清+25%Hank’s平衡液+葡萄糖(均購(gòu)自Gibco公司)，無(wú)糖培養(yǎng)液(成分同上，但不加葡萄糖)，Geys平衡鹽溶液，丁苯酞原料藥(NBP，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司免費(fèi)提供)，DMSO，Propidium iodide(Sigma)，bcl-2，bax，bim蛋白抗體(Bioworld Technology)，免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.2 大腦皮質(zhì)器官型腦片的制備 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4，5]，選用7 d齡SD大鼠的乳鼠，消毒后迅速斷頭、冰上快速剝離出完整腦組織，取頂葉皮質(zhì)修整成約0.5 mm×0.8 mm×0.4 mm組織塊，剝除軟腦膜后用Mcllwain組織切片機(jī)連續(xù)切成約350 μm冠狀切片，放于6孔板內(nèi)insert半透膜上，每孔3片，于CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，箱內(nèi)持續(xù)通入5%CO2和95%空氣的混合氣體，溫度維持在37 ℃。

1.3 腦片缺血缺氧模型(OGD)的建立及NBP的干預(yù) 取培養(yǎng)2 w的腦片隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、模型組(M組)、溶劑對(duì)照組(Sc組，溶劑為甲基亞砜(DMSO)和實(shí)驗(yàn)組(T組)，每組9片，M組、Sc組以及T組更換無(wú)糖培養(yǎng)液(含PI 1μg/ml)，置于厭氧培養(yǎng)罐中，用空氣真空泵抽出罐內(nèi)的空氣，充入5%CO2+95%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后，M組更換正常培養(yǎng)液(含PI 1 μg/ml)，Sc組更換等量DMSO但不含NBP的正常培養(yǎng)液(含PI 1 μg/ml)，T組更換添加NBP(10 μM)的正常培養(yǎng)液(含PI 1 μg/ml)，正常條件孵育。C組同時(shí)更換2次正常培養(yǎng)液(含PI 1 μg/ml)，正常條件孵育。NBP需事先以DMSO溶解稀釋。

1.4 腦片PI染色 用培養(yǎng)液把PI染料稀釋成1 μg/ml的終濃度，加入C組、M組、Sc組和T組，于培養(yǎng)箱孵育20 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，在0 h(OGD前)及OGD復(fù)氧復(fù)糖1 h、24 h、72 h拍照，使用Image-Pro Plus5.1軟件處理，計(jì)算每張照片的熒光強(qiáng)度的強(qiáng)度值。由于腦片厚度的不同可能會(huì)導(dǎo)致背景熒光的差異，需要對(duì)測(cè)得的熒光值進(jìn)行矯正。設(shè)定測(cè)得的熒光值為Gm，那么最終的值G=Gm/G0*G0 cont/G cont，其中G0是實(shí)驗(yàn)?zāi)X片OGD之前所測(cè)值，G0 cont是對(duì)照組在OGD之前所測(cè)得的平均值，G cont是對(duì)照組在處理的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的平均值。

1.5 石蠟切片的制備及染色 在培養(yǎng)2 w時(shí)，將腦片做OGD干預(yù)后，制備成5 μm石蠟切片，每個(gè)腦片取3張切片進(jìn)行HE染色。取4 μm石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。一抗為兔抗大鼠bcl-2、bax、bim多克隆抗體稀釋液(1∶100)，二抗為生物素化羊抗兔IgG，三抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，按照SP法進(jìn)行免疫組化染色。PBS為空白對(duì)照，結(jié)果為陰性。棕褐色為陽(yáng)性染色，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 器官型腦片大體觀察 腦片種植于insert之后約10 min開(kāi)始貼壁，3 d后即可在insert半透膜上牢固附著，可進(jìn)行更換培養(yǎng)液等操作。腦片在體外培養(yǎng)存活良好，肉眼觀可見(jiàn)腦片呈啞光白色，組織邊緣整齊，清晰，無(wú)明顯的壞死區(qū)域。

2.2 腦片石蠟切片的HE染色 培養(yǎng)2 w后所制備的切片可見(jiàn)C組清晰的細(xì)胞核及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并且可見(jiàn)皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)特有的大錐體細(xì)胞；OGD后可見(jiàn)M組和T組細(xì)胞數(shù)量減少，尤其M組明顯，部分細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核溶解，但多數(shù)細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡中未見(jiàn)明顯壞死表現(xiàn)(見(jiàn)圖1)。

2.3 腦片的OGD模型及藥物干預(yù)的PI染色 見(jiàn)表1。

2.3.1 器官型腦片M組、SC組和T組OGD30 min后，恢復(fù)正常氧糖含量并按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃分別予以不同處理。C組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度的總體均數(shù)相等(P>0.05)。M組隨時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05)，說(shuō)明OGD后存在急性期細(xì)胞死亡，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞死亡逐漸增多(見(jiàn)圖2)；M組和SC組兩組之間的熒光強(qiáng)度無(wú)差別，說(shuō)明DMSO對(duì)OGD復(fù)氧復(fù)糖后細(xì)胞損傷并無(wú)加重或減輕作用。

2.3.2 T組隨時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度呈輕度增強(qiáng) 各T組間熒光強(qiáng)度有差異(P<0.05)，說(shuō)明隨時(shí)間延長(zhǎng)仍存在細(xì)胞死亡；與M組比較，T組各時(shí)間點(diǎn)熒光均有降低(P<0.05)，說(shuō)明NBP干預(yù)后早期即出現(xiàn)抑制細(xì)胞死亡的保護(hù)作用，并隨時(shí)間延長(zhǎng)有持續(xù)抑制作用，其中72 h時(shí)間點(diǎn)T組熒光強(qiáng)度降低幅度最大，說(shuō)明持續(xù)應(yīng)用NBP能達(dá)到更佳療效。結(jié)果表明NBP干預(yù)后隨時(shí)間延長(zhǎng)具有減少OGD后細(xì)胞損傷的作用，進(jìn)一步阻斷細(xì)胞死亡的進(jìn)展。

2.4 免疫組化染色及分析結(jié)果 見(jiàn)表2。免疫組化染色中，OGD復(fù)氧復(fù)糖6 h后M組和T組抗凋亡蛋白bcl-2和促凋亡蛋白bax、bim陽(yáng)性細(xì)胞均表達(dá)增多，與C組比較差異顯著(P<0.05)；應(yīng)用NBP干預(yù)的T組與M組比較，bcl-2表達(dá)明顯增多，bax、bim表達(dá)均降低(P<0.05)，說(shuō)明培養(yǎng)液中加入NBP后腦片細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞減少(見(jiàn)圖3～5)。

表1 4組不同時(shí)期熒光強(qiáng)度比較 ±s)

與 C組比較*P<0.05；與OGD 1 h組比較#P<0.05；與OGD 24 h組比較△P<0.05；與M組及Sc組比較□P<0.05

表2 3組bcl-2，bax，bim的表達(dá)

與C組比較*P<0.05；與M組比較#P<0.05

圖1 HE染色，對(duì)照組C可見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，模型組M和實(shí)驗(yàn)組T可見(jiàn)部分細(xì)胞腫脹、數(shù)量減少

圖2 模型組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)亮度增加(A：對(duì)照組；B：OGD 1 h；C：OGD 24 h；D：OGD 72 h)

圖3 OGD 6 h bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞在C、M、T組中表達(dá)依次增加

圖4 OGD 6 h bax陽(yáng)性細(xì)胞在M組中表達(dá)最高，T組有降低，但均高于C組

圖5 OGD 6 h bim陽(yáng)性細(xì)胞在M組中表達(dá)最高，T組有降低，但均高于C組

3 討 論

器官型腦片是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種器官型培養(yǎng)方法，與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)相比，保留了細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系，可以模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，有效監(jiān)控特定細(xì)胞周圍的微環(huán)境，施加實(shí)驗(yàn)因素，因此是探討大腦結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生理功能和病理改變等問(wèn)題比較理想的方法，近年來(lái)成為神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇了出生后7 d SD乳鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)制備器官型腦片，選用厭氧培養(yǎng)罐作為密閉容器，并用95%N2+5%CO2的預(yù)混氣體，成功建立了OGD模型。經(jīng)過(guò)PI熒光染色統(tǒng)計(jì)分析說(shuō)明了模型的可靠性[6]。

PI是一種非常穩(wěn)定的熒光染料，可溶于水，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能夠透過(guò)凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合激發(fā)出紅色熒光。研究表明，PI的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞死亡的個(gè)數(shù)成正比[7]。本實(shí)驗(yàn)用PI染色，M組在OGD 1 h后PI熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，之后在72 h內(nèi)熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì)，說(shuō)明在OGD早期細(xì)胞發(fā)生了急性壞死，并且在復(fù)氧復(fù)糖后的培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)了遲發(fā)型細(xì)胞凋亡。NBP干預(yù)組中24 h、72 h的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組下降，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明NBP對(duì)凋亡具有抑制作用，與既往的研究結(jié)果相同[8，9]。

細(xì)胞凋亡是能量依賴的程序性的細(xì)胞死亡[1]，線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)換在細(xì)胞凋亡中起到很重要的作用，可以引起細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而引起其下游一系列凋亡蛋白酶的激活，從而引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。正常情況下線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)換孔道被bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白成員所阻斷。Bcl-2蛋白家族包括一個(gè)抗凋亡亞族和兩個(gè)促凋亡亞族，其中bcl-2為抗凋亡蛋白，bax和bim為促凋亡蛋白。因bcl-2蛋白家族對(duì)線粒體通透性孔道的重要性及繼之細(xì)胞的命運(yùn)-凋亡與否密切相關(guān)，因此對(duì)于這些蛋白的研究成為細(xì)胞凋亡研究中很重要的內(nèi)容。

bcl-2和bax是細(xì)胞凋亡中很重要的調(diào)節(jié)蛋白。bcl-2主要通過(guò)阻止細(xì)胞凋亡的早期環(huán)節(jié)發(fā)揮作用[11]，阻止或降低細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮和DNA裂解的發(fā)生。Bax通過(guò)其自身形成的bax同二聚體具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，與bcl-2形成bax-bcl-2異二聚體而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生[12]。正常情況下bcl-2與bax結(jié)合從而阻止bax、bax異二聚體的形成。在凋亡刺激因子的作用下bax從bcl-2蛋白分離形成bax同二聚體，并與其他促凋亡蛋白相互作用從而促進(jìn)線粒體外膜孔道的開(kāi)放，引起凋亡的發(fā)生。如果bcl-2表達(dá)水平高于bax，細(xì)胞可以存活，反之則死亡。本實(shí)驗(yàn)研究了OGD復(fù)氧復(fù)糖后凋亡相關(guān)蛋白的變化及NBP干預(yù)后情況，結(jié)果表明C組細(xì)胞中抗凋亡蛋白bcl-2、促凋亡蛋白bax表達(dá)較少；M組OGD復(fù)氧復(fù)糖后6 h兩者表達(dá)均明顯升高，其中bax升高更加明顯，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生早期凋亡；T組加入NBP后bcl-2較M組升高、bax較M組降低，但仍明顯高于C組，說(shuō)明在加入NBP后形成更多bcl-2，并且部分抑制bax形成，細(xì)胞凋亡減少。故NBP抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與增加bcl-2、降低bax蛋白表達(dá)量有關(guān)。

此外，bim所在的促凋亡蛋白BH3only家族可以通過(guò)在凋亡刺激因素中蛋白量的變化以及磷酸化、去磷酸化而發(fā)揮作用[13，14]；可與bcl-2等抗凋亡蛋白結(jié)合，釋放出更多的bax、bak等蛋白[15]；或直接與bax、bak等結(jié)合并激活之，參與形成線粒體外膜孔道形成，在凋亡中起到重要作用[16]。本實(shí)驗(yàn)表明bim在OGD后明顯增多，加入NBP后表達(dá)下降，說(shuō)明NBP可通過(guò)減少OGD后bim表達(dá)減輕細(xì)胞凋亡。因此，今后可對(duì)bim蛋白磷酸化水平進(jìn)行研究，探索藥物的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)器官型腦片OGD模型中NBP的應(yīng)用，將藥物在體外直接作用于腦組織，證明了其在細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用，并且從對(duì)bcl-2蛋白家族中代表性蛋白的變化研究，探索了其對(duì)線粒體保護(hù)、減少細(xì)胞凋亡、減輕細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。

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The effect of NBP on bcl-2/bax and bim proteins in oxygen-glucose deprivation model of organotypic brain slices

DONGMei，CHENGShubin，GUOYanfang，etal.

(DepartmentofNeurology，KeyLaboratoryofNeurologyofHebeiProvince，TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China)

Objective To establish the oxygen and glucose deprivation (OGD) model of organotypic brain slices of rat cerebral cortex and observe the effects of n-butyl phthalide (NBP) on bcl-2、bax、bim protein in apoptosis. Method We chose the post-natal 7-day rats(SD) to culture the brain slices on the membrane insert and they were divided into four groups after having been cultured for two weeks：control group (group C)，model group (group M)，the solvent control group (group Sc) and test group (group T). Group T were given NBP 10μM to brain slices after treating with OGD30 min. Some brain slices were observed by PI dyeing before and after being gived NBP 1 h，24 h and 72 h. Other brain slices were fixed by glutaral after 6 h treated with NBP and were dying by HE and assessed the positive cells of bcl-2、bax、bim in brain slices of different groups. Results Brain slices showed no different brightness of red fluorescence in group C and showed increased brightness according to different time in group M，group Sc and group T by PI staining. There were no variety in group M and group Sc. But the brightness was dicreased in group T than that of group M especially in 72 h (P<0.05). There were typital giant pyramidal cells in cortical motor area with normal structures. There were much more swelling cells with karyolysis in group M than that in group T. There were more positive cells in group M and group T than that in group C. Among them there were more positive cells of bcl-2 in group T and more positive cells of bax and bim in group M. There were statistic variance in three groups with each dying of bcl-2，bax and bim. Conclusion NBP had protective effect on damaged brain slice after OGD. NBP could decrease apoptosis by controlling the protein of bcl-2，bax and bim.

Organotypic brain slices； Oxygen and glucose deprivation； N-butyl phthalide； Apoptosis； bcl-2； Bax； Bim.

1003-2754(2017)01-0016-05

2016-09-20；

2016-12 -26

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，神經(jīng)病學(xué)河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056002；3.邢臺(tái)市一院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 059001；4.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊 050051)

李春巖，E-mail：lichuny@126.com

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