嚴(yán) 歡 蔣子鴻 康雨彤 賀金華*

1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；2.新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 烏魯木齊 830026

維藥降糖孜亞比提片定性定量方法研究

嚴(yán) 歡1蔣子鴻2康雨彤1賀金華1*

1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；2.新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 烏魯木齊 830026

目的：建立維藥降糖孜亞比提片的定性定量方法。方法：采用薄層色譜法對鹿茸、人參和石榴皮進(jìn)行薄層鑒別。采用高效液相色譜法對人參中特征成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1進(jìn)行含量測定。結(jié)果：薄層色譜中，定性鑒別斑點(diǎn)清晰，且陰性無干擾，方法穩(wěn)定可靠。人參皂苷Rg1對照品在0.0151～0.4840 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r=0.9996)，平均回收率(n=6)為96.20%，RSD為1.58%；人參皂苷Re對照品在0.0584～0.9340 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r=1)，平均回收率(n=6)為102.14%，RSD為1.64%；人參皂苷Rb1對照品在0.0689～1.1020 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r=1)，平均回收率(n=6)為97.15%，RSD為1.36%。結(jié)論：采用該方法專屬性好，靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于維藥降糖孜亞比提片的質(zhì)量控制。

降糖孜亞比提片；薄層色譜法；高效液相色譜法；人參；人參皂苷

降糖孜亞比提片由歐玉竹、鹿茸、人參、石榴皮、香茅等共10味藥組成。方中香茅、石榴皮為水提??；鹿茸為70%醇提取后再用水提?。黄溆?味粉碎成細(xì)粉與上述2種浸膏粉及輔料混勻、壓片。處方來源于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)——維吾爾藥分冊》(1999年版)[1]，標(biāo)準(zhǔn)號：WS3-BW-0159-98，是按照維吾爾醫(yī)理論組方的維藥復(fù)方制劑，具有益腎健身，收斂固澀的作用，臨床用于自然力攝住力下降引起的尿多、煩渴、疲乏、消瘦等糖尿病病癥。為了保證制劑的質(zhì)量，現(xiàn)對該方中的主要藥味進(jìn)行了薄層鑒別和含量測定研究。

人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖。人參味甘、微苦，微溫。歸脾、肺、心、腎經(jīng)。功效為大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智。用于體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、肺虛喘咳、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、氣血虧虛、久病虛贏、驚悸失眠、陽痿宮冷的病癥[2]。人參既為主藥又為貴重藥材，其主要活性成分是人參皂苷，故以人參對照藥材及人參皂苷Rg1，Re，Rf和Rb1進(jìn)行薄層鑒別，以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1對照品為指標(biāo)，采用HPLC法測定制劑中三種人參皂苷的含量，以控制藥品質(zhì)量。鹿茸中含有多種化學(xué)成分，其中總氨基酸含量達(dá)50%以上，有甘氨酸、賴氨酸等10余種，本制劑中所用藥材為馬鹿茸，故本實(shí)驗(yàn)主要鑒別馬鹿茸對照藥材及甘氨酸。石榴皮中含鞣質(zhì)10.4%～21.3%，沒食子酸4.0%，故本實(shí)驗(yàn)主要鑒別石榴皮對照藥材及沒食子酸對照品[3-5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AS20500BDT超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)儀器設(shè)備有限公司)；HHS21-NI4電熱恒溫水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠)；Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)；色譜柱：Cosmosil ODS C18(4.6mm×250mm，5μm)、Cosmosil ODS C18(pH1-7)(4.6mm×250mm，5μm)、Agilent TC C18(4.6mm×250mm，5μm)；BP-211D電子天平(Sartorias公司)。

1.2 試藥 降糖孜亞比提片(中試產(chǎn)品批號：20121101，20121102，20121103，和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司)；全部藥材購自新疆和田，經(jīng)質(zhì)檢科鑒定，質(zhì)量符合《中國藥典》2010年版一部、《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)--維吾爾藥分冊》1999年版和《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn) 上冊》的有關(guān)規(guī)定，其中歐玉竹和西黃蓍膠無藥材標(biāo)準(zhǔn)。

甘氨酸(批號：110735-200102)、人參皂苷Re(批號：110754-201123)、人參皂苷Rf(批號：111719-201104)、人參皂苷Rb1(批號：110704-200420)、人參皂苷Rg1(批號：0703-200119)、沒食子酸(批號：110831-200302)均購于中國食品藥品檢定研究院；馬鹿茸(批號：121570-021001)、人參(批號：120917-201110)、石榴皮(批號：121043-200403)，均購于中國食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)，聚酰胺薄膜(薄層層析，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)，乙腈為色譜級(Fisher公司)，其余化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 鹿茸 取本品8片，研細(xì)，加70%乙醇5mL，超聲處理15min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取鹿茸對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。再取甘氨酸對照品，加70%乙醇制成每1mL含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各8μL、對照品溶液1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(3：1：1)為展開劑，展開、取出、晾干，噴以2%茚三酮丙酮溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾。見圖1。

2.1.2 人參 取本品20片，研細(xì)，加三氯甲烷100mL，加熱回流1h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水5mL攪拌濕潤，加水飽和正丁醇50mL，超聲處理30min，吸取上清液加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上層液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rf對照品及人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每1mL各含2mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各1～2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365nm)下檢視[6]。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾，故列入正文。見圖2。

2.1.3 石榴皮 取本品20片，研細(xì)，加無水乙醇30mL，加熱回流1h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，濾過，濾液用石油醚(60℃～90℃)振搖提取2次，每次20 mL，棄去石油醚液，水液再用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取石榴皮對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取沒食子酸對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10：1：1：1)為展開劑，展開、取出、晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾。見圖3。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品和人參皂苷Rb1對照品，加甲醇制成每1mL各含0.2mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品50片，研細(xì)，取約20g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇200mL，稱定重量，超聲(功率220 W，頻率40 kHz)提取30min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液100 mL，蒸去甲醇，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用三氯甲烷提取2次，每次30mL，合并三氯甲烷液，三氯甲烷液用水30mL洗滌，棄去三氯甲烷液，水液與上述水液合并；用水飽和的正丁醇提取3次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次30mL，合并堿液層，再用水飽和的正丁醇30mL提取，與上述正丁醇液合并；用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次30mL，正丁醇飽和的水的洗滌液依次用同一水飽和的正丁醇30mL提取，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)约状既芙獠⒍ㄈ葜?mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[7-13]。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 依照處方工藝，制備缺人參的陰性樣品，并按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～35 min，19%A；35～55 min，19%A→29%A；55～70 min，29%A；70～100 min，29%A→40%A；100～105 min，40%A→90%A；105～110 min，90%A→19%A；110～120 min，19%A)；檢測波長：203 nm；流速：1mL/min，柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。結(jié)果見圖4。

2.2.5 線性范圍的考察 分別精密吸取人參皂苷Rg1對照品(0.6050mg/mL)溶液、人參皂苷Re對照品(0.9340mg/mL)溶液、人參皂苷Rb1對照品(1.1020mg/mL)溶液各0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0 mL至5 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果人參皂苷Rg1、Re和Rb1線性關(guān)系均良好。見表1。

表1 線性關(guān)系結(jié)果(n=5)

2.2.6 儀器精密度 分別精密吸取對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，以測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面積值，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。測定結(jié)果人參皂苷Rg1的面積平均值(n=6)為703.1，RSD=1.60%；人參皂苷Re的面積平均值(n=6)為573.2，RSD=1.11%；人參皂苷Rb1的面積平均值(n=6)為445.4，RSD=1.53%。RSD值均小于2%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.2.7 供試品溶液穩(wěn)定性 精密稱取復(fù)方制劑粉末20g，依供制備試品溶液制備方法制備1份供試品溶液。分別在0、2、4、6、8、10、24、48、72、96、120h分別進(jìn)樣10μL，測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面積，計(jì)算含量(平均片重0.4942g)。由測定結(jié)果可知人參皂苷Rg1的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)日內(nèi)0.0183mg/片，日間0.0183mg/片，RSD值日內(nèi)為0.77%，日間為0.84%，人參皂苷Re的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)日內(nèi)0.0395mg/片，日間0.0391mg/片，RSD值日內(nèi)為0.77%，日間為1.83%，人參皂苷Rb1的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)日內(nèi)0.0722mg/片，日間0.0725mg/片，RSD值日內(nèi)為1.03%，日間為1.40%。表明供試品溶液在制備120h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性 取同一批次樣品6份，按供試品溶液制備方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)行測定。由測定結(jié)果可知人參皂苷Rg1+Re的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0578mg/片，RSD值為0.60%；人參皂苷Rb1的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0721mg/片，RSD值為1.04%。表明重復(fù)性良好。

2.2.9 準(zhǔn)確度 稱取已知含量的供試品10g，精密稱定，共6份，分別精密加入人參皂苷Rg1對照品溶液(每1mL含人參皂苷Rg10.0605mg)、人參皂苷Re對照品溶液(每1mL含人參皂苷Re 0.1168mg)、人參皂苷Re對照品溶液(每1mL含人參皂苷Re 0.1168mg)5mL，依供試品溶液制備方法同法操作，分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，計(jì)算準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.10 耐用性考察 取同一供試品溶液，分別采用三種不同品牌的色譜柱Cosmosil ODS C18(4.6mm×250mm，5μm)、Cosmosil ODS C18(pH1-7)(4.6mm×250mm，5μm)、Agilent TC C18(4.6mm×250mm，5μm)進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3。

表3 耐用性考察結(jié)果(n=3)

由表3可知，三種品牌色譜柱對人參皂苷含量的影響不大，均能準(zhǔn)確的對人參皂苷含量進(jìn)行測定。通過對色譜系統(tǒng)適用性中色譜理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子的綜合分析，最終決定選擇色譜柱：Cosmosil ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)。

2.2.11 樣品測定 分別精密稱取不同批次的復(fù)方制劑粉末20g，按照正文供試品溶液按制備方法處理，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣10μL，注入高效液相色譜儀，計(jì)算降糖孜亞比提片中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量，所測樣品中人參皂苷含量均符合要求。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果(mg/片，n=3)

3 討論

3.1 薄層鑒別 鹿茸、人參和石榴皮薄層鑒別均參考中國藥典2010年版一部各自項(xiàng)下的薄層鑒別方法，結(jié)果斑點(diǎn)均較清晰，且陰性樣品無干擾。

3.2 人參的HPLC含量測定 供試品溶液的制備采用了藥典方法(方法1)和改進(jìn)后方法(方法2)。方法1：取本品內(nèi)容物約20g，精密稱定，加甲醇100mL，超聲提取30min，過濾，提取液水浴蒸干，殘?jiān)铀m量溶解，至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次50mL，合并正丁醇液，加氨試液振搖提取3次，每次50mL，棄去氨試液，正丁醇層繼用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50mL，棄去水液，正丁醇層蒸干。殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。①方法2：取本品20片，研細(xì)，加三氯甲烷100mL，加熱回流1h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水5mL攪拌濕潤，加水飽和正丁醇50mL，超聲處理15min，吸取上清液加3倍量氨試液，搖勻，放置分層，取上層液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。②結(jié)果顯示：方法1雜質(zhì)峰含量高，人參皂苷Rb1分離效果差；方法2色譜圖雜質(zhì)含量低，分離度較好，故采用方法2制備供試品溶液。

綜上，該方法專屬性好，靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于維藥降糖孜亞比提片的質(zhì)量控制。

[1]衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(維吾爾藥分冊)[S].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1999.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

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[4]劉勇民.維吾爾藥志(上冊)[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1999.

[5]中華本草編委會.中華本草(維吾爾藥卷)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2005.

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(編輯：陶希睿)

Study on Qualitative and Quantitative Methods of Jiangtangziyabiti Tablets

YAN Huan1JIANG Zihong2KANG Yutong1HE Jinhua1*

1.Xinjiang Institute of Material Medica, Urmuqi 830004, China； 2.Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co.,Ltd, Urmuqi 830026, China

Objective To establish the qualitative and quantitative methods of Jiangtangziyabiti tablets.Methods Cervi Cornu Pantotrichum, Ginseng Radix et Rhizoma and Granati Pericarpium were identified by TLC.To establish the HPLC methods to determine the content of three ginsenosides: Rg1, Re and Rb1in Jiangtangziyabiti tablets.Results Identification spots were clear, and this methods was stable and reliable.The ginsenoside Rg1control in 0.0151 ～ 0.4840 mg/mL range, good linear relationship,r=0.9996, average recovery=96.20%,RSD=1.58%; ginsenoside Re control in 0.0584 ～ 0.9340 mg/mL range, good linear relationship,r=1, the average recovery rate-102.41%,RSD=1.64%.ginsenoside Rb1control in 0.0689 ～ 1.1020 mg/mL range, good linear relationship,r=1, the average recovery rate=97.15%,RSD=1.36%.Conclusion This method is simple, reliable, stable and can control the quality of ginseng in compound preparation.

Jiangtangziyabiti Tablets; TLC; HPLC; Ginseng; Ginsenoside

2016-11-07

嚴(yán)歡(1981-)，女，漢族，副研究員，碩士，研究方向?yàn)榫S吾爾藥分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：19835500@qq.com

賀金華(1981-)，女，漢族，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榫S吾爾藥分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：3482410@qq.com

R283

A

1007-8517(2017)02-0028-05