何 薇 趙 峰 張國(guó)平 王 輝 石 碩 裴宏磊

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院手外科，河北 石家莊 050051)

透明質(zhì)酸對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞白細(xì)胞介素-1β及腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響

何 薇 趙 峰1張國(guó)平1王 輝1石 碩1裴宏磊1

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院手外科，河北 石家莊 050051)

目的 研究透明質(zhì)酸(HA)對(duì)大鼠創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)炎離體細(xì)胞模型白細(xì)胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α的影響。方法 體外分離、培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞成功后，加入不同濃度的透明質(zhì)酸鈉，1 h后以10 μg/L的IL- 1β刺激，培養(yǎng)24 h后，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)軟骨細(xì)胞膜ATP，IL-1β和TNF-α水平。結(jié)果 IL-1β組軟骨細(xì)胞線粒體ATP丟失較正常軟骨細(xì)胞顯著升高；IL-1β和TNF-α水平在IL-1β組顯著升高，與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。透明質(zhì)酸鈉干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞后，H20組和H40組的IL-1β及TNF-α水平明顯低于IL-1β組(P<0.05)，而H10組中IL-1β及TNF-α水平與IL-1β組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 透明質(zhì)酸鈉能夠減少大鼠創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞線粒體ATP的丟失，下調(diào)IL-1β和TNF-α水平。

透明質(zhì)酸；軟骨細(xì)胞；白細(xì)胞介素-1β；腫瘤壞死因子-α

骨關(guān)節(jié)炎(OA)主要是由于關(guān)節(jié)軟骨退變誘發(fā)的。關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨，由于組織代謝活性低導(dǎo)致血液供應(yīng)差，且軟骨細(xì)胞分裂緩慢，通常不能修復(fù)〔1〕。透明質(zhì)酸(HA)是一種自然軟骨基質(zhì)，從結(jié)構(gòu)上講是一種不含硫酸基的多聚糖，它的立體結(jié)構(gòu)孔隙率高，增加其自身的表面積和空間，從而利于細(xì)胞在其中黏附并生長(zhǎng)，同時(shí)還可以沉積大量的細(xì)胞外基質(zhì)，為營(yíng)養(yǎng)和氣體進(jìn)入及排出代謝產(chǎn)物提供便利，從而作為一種良好的材料與細(xì)胞接觸〔2〕。目前HA上多用于治療OA，療效顯著，副作用少。本研究為了驗(yàn)證HA與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的組織相容性，分別在大鼠創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)炎在體模型和離體細(xì)胞模型上驗(yàn)證HA對(duì)軟骨細(xì)胞退變產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠12只，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK(遼)2013-0006，體質(zhì)量300～350 g，平均體質(zhì)量(324.6±13.1)g，分籠飼養(yǎng)，自由飲食。隨機(jī)均分為透明質(zhì)酸鈉組和空白對(duì)照組。

1.1.2 試劑 透明質(zhì)酸鈉由博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司提供。DMEM培養(yǎng)液和D′Hanks 液均由Gibco公司提供，胎牛血清由四季青公司提供，胰蛋白酶、膠原酶和白細(xì)胞介素(IL)-1β均購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 材料和設(shè)備 24和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均由Gibco公司提供，Shel-Lable公司的CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)由無(wú)錫一凈凈化設(shè)備有限公司提供，倒置顯微鏡由日本Olympus公司提供，分光光度儀和Reder酶標(biāo)儀購(gòu)自日本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠創(chuàng)傷性膝節(jié)炎模型的建立 腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，將手術(shù)部位附近的毛減掉，并鋪上消毒巾，在右膝內(nèi)側(cè)做一長(zhǎng)約1 cm的切口，將皮膚及深筋膜切開(kāi)，盡量使前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板暴露在視野范圍內(nèi)，在切斷前交叉韌帶的同時(shí)，將半月板切除，之后按照順序逐層縫合傷口。術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素鈉，以預(yù)防感染，傷口縫合3 w后，于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉0.2 ml，空白對(duì)照組不注射任何藥物。

1.2.2 大鼠軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 在關(guān)節(jié)腔中注射透明質(zhì)酸鈉治療8 w后，在無(wú)菌條件下，取出SD大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨。并使用刀片切成1 mm3大小的碎塊，先后分別采用胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶將關(guān)節(jié)軟骨的小碎塊消化，得到軟骨細(xì)胞懸液。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中接種軟骨細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h，溫度設(shè)置為37℃，細(xì)胞貼壁后，第2天換液。使用0.02%的EDTA沖洗鋪滿軟骨細(xì)胞的瓶底，并使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，最后進(jìn)行離心，收集其中的軟骨細(xì)胞。

1.2.3 HA干預(yù) 將收集的軟骨細(xì)胞按每孔20×105密度種于6 孔板，每孔加含培養(yǎng)液2 ml，置于飽和濕度5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為37℃、濕度設(shè)置為95%，各病例各種一板。48 h后根據(jù)細(xì)胞的貼壁情況決定是否更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞80%匯合后，吸棄原培養(yǎng)液，分別加入含不同劑量HA的培養(yǎng)液2 ml，每個(gè)6孔板分為3組，每組2孔，分別為空白對(duì)照組、IL-1β組、IL-1β+10 mg/ml HA組(H10組)、IL-1β+20 mg/ml HA組(H20組)、IL-1β+40 mg/ml HA組(H40組)，培養(yǎng)24 h后，取上清，-20℃保存。

1.2.4 大鼠軟骨細(xì)胞線粒體膜ATP觀察 在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的透明質(zhì)酸鈉，培養(yǎng)2 h后加入10 ng/ml的IL-1β處理24 h。軟骨細(xì)胞對(duì)照組中不加任何物質(zhì)。以若丹明-123熒光染料處理對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè) 將細(xì)胞培養(yǎng)上清液按相應(yīng)ELISA試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 透明質(zhì)酸鈉對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞線粒體膜及細(xì)胞核形態(tài)的影響 IL-1β組軟骨細(xì)胞的線粒體ATP的丟失較正常軟骨細(xì)胞細(xì)胞顯著升高；透明質(zhì)酸鈉可以顯著逆轉(zhuǎn)線粒體ATP的丟失，而且這種效應(yīng)隨透明質(zhì)酸鈉濃度的增加而愈加顯著，見(jiàn)圖1。

圖1 透明質(zhì)酸鈉對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞線粒體膜ATP的影響(×200)

2.2 透明質(zhì)酸鈉對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞IL-1β及TNF-α表達(dá)的影響 IL-1β和TNF-α水平在IL-1β組中顯著升高，與空白對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)。透明質(zhì)酸鈉干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞后，H20組和H40組的IL-1β及TNF-α水平明顯低于IL-1β組(P<0.05)，而H10組中IL-1β及TNF-α水平與IL-1β組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

指標(biāo)空白對(duì)照組IL-1β組H10組H20組H40組IL-1β(pg/ml)1.68±0.2015.98±1.0651)15.68±1.259.248±0.912)5.67±0.942)TNF-α(pg/ml)1.53±0.1718.95±1.171)18.44±1.0712.48±0.9432)6.45±0.9872)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與IL-1β組比較：2)P<0.05

3 討 論

OA是一種慢性炎癥性退行性疾患〔3〕，是臨床常見(jiàn)的關(guān)節(jié)病，其病理基礎(chǔ)是關(guān)節(jié)軟骨的退變，也包括軟骨的退變破壞，以及軟骨、滑膜、肌腱、韌帶等的綜合性病變。常伴有關(guān)節(jié)疼痛、軟骨退化，最終喪失正常的關(guān)節(jié)功能〔4,5〕。以非甾體類抗炎藥為代表的藥物治療主要以控制癥狀和減輕疼痛為主。OA患者隨著病情的進(jìn)展，病情加重，初期病情較輕，但是晚期會(huì)出現(xiàn)例如關(guān)節(jié)腫痛等較嚴(yán)重臨床癥狀，有甚者需要更換關(guān)節(jié)來(lái)延續(xù)生命〔6〕。HA是一種天然的非硫酸化黏多糖，在關(guān)節(jié)軟骨、滑液、皮膚和房水中均存在，主要參與生物化學(xué)調(diào)節(jié)，不僅具有支持和潤(rùn)滑的作用，而且還可以維持關(guān)節(jié)的正常功能〔7,8〕。HA治療OA的主要機(jī)制：①可以通過(guò)抑制組織疼痛感受器，阻斷電信號(hào)的傳導(dǎo)；②外界給予一定的HA可以誘導(dǎo)體內(nèi)生成HA，從而提高HA在體內(nèi)的濃度；③通過(guò)抑制金屬基質(zhì)蛋白酶而發(fā)揮抗炎作用。Joos等〔9〕于20世紀(jì)60年代首次提出黏彈性補(bǔ)充療法的概念，通過(guò)向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射大分子量的透明質(zhì)酸鈉溶液，不僅可以使得關(guān)節(jié)的黏彈性恢復(fù)，使得透明質(zhì)酸鈉重新對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)作用，而且還可以降低滑膜炎癥嚴(yán)重程度，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能〔2〕。Wen〔10〕發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在體外或體內(nèi)，透明質(zhì)酸鈉溶液和正?；耗軌蛎黠@抑制淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的游走及轉(zhuǎn)化，并減少炎癥因子的釋放量。臨床應(yīng)用透明質(zhì)酸鈉潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、保護(hù)軟骨、延緩關(guān)節(jié)炎發(fā)展取得了很好的療效〔11〕。

正常的關(guān)節(jié)軟骨光滑，富有彈性和耐磨特性，可以對(duì)關(guān)節(jié)產(chǎn)生傳導(dǎo)載荷、吸收震蕩、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)的作用，從而維持關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定〔12〕。軟骨細(xì)胞損傷后基質(zhì)金屬蛋白酶、IL-6及由巨噬細(xì)胞分泌IL-17等炎性因子釋放，并積極參與關(guān)節(jié)軟骨的退變進(jìn)程〔13〕。IL-17促進(jìn)滑膜細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α，后者也能促進(jìn)IL-17的代謝，IL-17與IL-1β、TNF-α相互作用在加重滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨退變嚴(yán)重程度的同時(shí)，阻斷軟骨細(xì)胞增殖進(jìn)程〔9〕，反過(guò)來(lái)這兩種遞質(zhì)可破骨細(xì)胞活性，加速了創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展〔9,14〕。本研究結(jié)果提示透明質(zhì)酸鈉可以顯著逆轉(zhuǎn)線粒體ATP的丟失，同時(shí)能夠顯著下調(diào)大鼠軟骨細(xì)胞IL-1β及TNF-α的水平，其下調(diào)效應(yīng)依賴透明質(zhì)酸鈉的干預(yù)濃度。在OA的形成發(fā)展過(guò)程中，炎性因子的相互作用導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞加速，并且提高促炎因子的合成與釋放，加速巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞在炎癥部位的聚集，同時(shí)還降低其吞噬能力溶酶體酶的釋放量，從而加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞。透明質(zhì)酸鈉可減輕和防止炎癥反應(yīng)，減少炎性因子對(duì)軟骨的破壞，而且透明質(zhì)酸鈉的高孔隙率立體結(jié)構(gòu)，使其具有更大的表面積，能夠提供良好的材料-細(xì)胞作用界面，埋藏于細(xì)胞基質(zhì)中，具有提高細(xì)胞間黏附性的作用，為軟骨提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，維持軟骨的特性，潤(rùn)滑關(guān)節(jié)。 綜上，透明質(zhì)酸鈉作為一種理想的液態(tài)修復(fù)材料，與關(guān)節(jié)軟骨有較好的組織相容性，且操作簡(jiǎn)便，有望成為關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的重要工具。

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〔2015-03-30修回〕

(編輯 李相軍)

河北省2015年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(No.20150640)

趙 峰(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事關(guān)節(jié)損傷與修復(fù)方面的研究。

何 薇(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事手部關(guān)節(jié)損傷與修復(fù)方面的研究。

R68

A

1005-9202(2017)01-0025-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.010

1 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科