趙靜怡 張樹峰 姚銀輝 顧媛媛 時(shí)昭平 周曉慧

(承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000)

丹皮酚對(duì)大鼠急性心肌梗死后核因子-κB p65通路的影響

趙靜怡 張樹峰 姚銀輝1顧媛媛 時(shí)昭平 周曉慧

(承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000)

目的 探討丹皮酚對(duì)大鼠急性心肌梗死后(AMI)心肌組織核因子(NF)-κB p65通路的影響。 方法 大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立AMI模型，分為模型組和丹皮酚低、中、高劑量組4、6、8 mg·kg-1·d-1及卡托普利組10 mg·kg-1·d-1；另設(shè)假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。連續(xù)給藥4 w后處死大鼠，Masson染色法分析心肌組織膠原沉積變化；免疫組化法檢測(cè)p-IκB及 NF-κB p65蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 4、6、8 mg·kg-1·d-1丹皮酚給藥4 w后,大鼠心肌組織的膠原沉積量較模型組顯著減少。丹皮酚還可下調(diào)心肌組織中NF-κB p65、p-IκB的蛋白表達(dá)。 結(jié)論 丹皮酚對(duì)大鼠AMI后心室重構(gòu)有明顯的治療和改善作用,抑制NF-κB p65的表達(dá)和活化是其作用機(jī)制之一。

丹皮酚；急性心肌梗死；核因子-κB p65

心肌缺血后氧自由基生成過(guò)多和(或)抗氧化能力減弱均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，尤其是活化的核因子(NF)-κB由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)相關(guān)炎癥因子的大量表達(dá)是導(dǎo)致室壁增厚及膠原過(guò)度沉積出現(xiàn)嚴(yán)重病理改變的重要因素〔1〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究丹皮酚具抗心律失常、改善血管內(nèi)皮功能、抑制心肌間質(zhì)纖維化〔2〕，對(duì)心肌有良好的保護(hù)作用及抗炎作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)以急性心肌梗死(AMI)大鼠為模型，觀察丹皮酚對(duì)AMI大鼠心肌組織NF-κB p65/IκB蛋白表達(dá)的影響，探討丹皮酚改善心室重構(gòu)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑 健康雄性Wistar大鼠，體重280～300 g，北京華阜康生物科技有限公司(批號(hào)：SCXK京2009-0004 0245860)；丹皮酚注射液(寧波天真制藥有限公司/批號(hào)：20110603/規(guī)格：10 mg)，卡托普利(江蘇平光制藥有限公司/批號(hào)：120102/規(guī)格：25 mg)；兔抗NF-κB p65抗體、鼠抗p-IκB抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；免、鼠免疫組化試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；病理特殊染色液套盒(Masson染色專用)珠海貝索生物技術(shù)有限公司； RIPA裂解液，上海貝博生物；其他試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器 ECG-11D心電圖機(jī)，惠州科美思醫(yī)用儀器有限公司；小動(dòng)物人工呼吸機(jī)淮北正華生物科技有限公司；酶標(biāo)儀，MK-3，芬蘭Thermo公司；冷凍離心機(jī)，德國(guó) Kendro Labrotary公司；SIM-F124 制冰機(jī)，日本SANYO 公司； STP120自動(dòng)組織處理機(jī)、171型組織自動(dòng)包埋機(jī)，美國(guó)Thermo Electron Corporation；TK-218型恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)，湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立與分組 健康雄性Wistar大鼠70只在實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)1 w，適應(yīng)環(huán)境。然后隨機(jī)抽取10只制作假手術(shù)組，其余60只大鼠8%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)氣管插管連接呼吸機(jī)，左側(cè)腋下三、四肋間逐層開胸，于左心耳下緣2 mm處使用無(wú)菌線完全結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，然后立即逐層關(guān)胸并縫合。觀察大鼠心電圖ST段的變化，以ST段持續(xù)抬高并出現(xiàn)室性心律失常作為判斷AMI模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后3 d將成模大鼠隨機(jī)分為5組：模型組(n=9)、丹皮酚低劑量組(n=8，4 mg·kg-1·d-1)、丹皮酚中劑量組(n=8，6 mg·kg-1·d-1)、丹皮酚高劑量組(n=8，8 mg·kg-1·d-1)、卡托普利組(n=8，10 mg·kg-1·d-1)；同時(shí)假手術(shù)組(n=8)在相同部位只穿線不結(jié)扎。丹皮酚用藥組每天經(jīng)腹腔注射1次，卡托普利經(jīng)灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組大鼠每天以等量生理鹽水灌胃，按等效體表面積計(jì)算同陽(yáng)性藥給藥體積，每周根據(jù)體重變化調(diào)整劑量，各組大鼠給藥時(shí)間均為4 w。

1.3.2 組織標(biāo)本采集與處理 給藥4 w，脫椎處死大鼠，結(jié)扎線下切取3～5 mm心肌組織， 10%甲醛固定，24 h后常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，Masson染色觀察心肌膠原沉積情況。同時(shí)切左心室取非梗死部位，用無(wú)菌錫箔紙包裹后迅速放于液氮罐中冷凍，24 h 后放于-80℃冰箱保存，用以免疫組化檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3 Masson染色觀察心肌膠原沉積情況 各組大鼠心肌組織5 μm連續(xù)切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇洗滌蒸餾后組織切片固定與Bouin液中過(guò)夜。其余按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.4 免疫組化法檢測(cè)肝組織NF-κB p65及IκB的蛋白表達(dá)情況 取大鼠心肌組織，4%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片后二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%H2O2-甲醇消除過(guò)氧化物， 0.01 mol/L(pH6.0)檸檬酸緩沖液微波修復(fù)；10%山羊血清封閉；NF-κB p65及p-IκB一抗(1∶100及1∶50稀釋)，4℃孵育過(guò)夜；37℃復(fù)溫30 min，滴加生物素標(biāo)記二抗；滴加HRP標(biāo)記鏈親和素；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性膠封片，鏡下觀察。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。 結(jié)果判定：NF-κB以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中出現(xiàn)淡黃至褐黃色顆粒狀著色者為陽(yáng)性表達(dá)；p-IκB以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃至褐黃色顆粒狀著色者為陽(yáng)性表達(dá)。IPP6.0測(cè)量心肌組織中NF-κB p65及p-IκB免疫組化染色的IOD值，計(jì)算光密度平均值，半定量檢測(cè)NF-κB p65核轉(zhuǎn)移變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，各組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 丹皮酚對(duì)AMI大鼠心肌組織膠原含量變化的影響 假手術(shù)組間質(zhì)只可見散在膠原，提示心肌基本未受損；模型組間質(zhì)膠原明顯增多，表明心室重構(gòu)確實(shí)發(fā)生；丹皮酚中、高劑量組間質(zhì)膠原有不同程度的減少以紅色心肌組織為主，間雜以膠原組織，也表明丹皮酚對(duì)心室重構(gòu)有改善作用；丹皮酚高劑量組間質(zhì)膠原的減少較卡托普利組更為明顯。見圖1。

2.2 丹皮酚對(duì)AMI大鼠心肌組織中NF-κB p65及IκB蛋白表達(dá)的影響 ①假手術(shù)組胞質(zhì)中僅有少量的p-IκB表達(dá)；模型組中p-IκB的表達(dá)顯著升高，提示心室重構(gòu)發(fā)生后，IκB的活化程度增強(qiáng)(P<0.05)；各用藥組p-IκB的表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05)；丹皮酚高劑量組p-IκB的表達(dá)減少更為明顯。見圖2，表1。②假手術(shù)組胞核中略見少量的NF-κB p65表達(dá)；模型組中NF-κB p65的表達(dá)顯著升高，提示IκB的活化程度增強(qiáng)導(dǎo)致NF-κB p65在胞核中表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)；丹皮酚用藥組NF-κB p65的表達(dá)較假手術(shù)組升高但較模型組顯著降低(P<0.05)；丹皮酚高劑量組NF-κB p65的表達(dá)減少更為明顯。見圖3，表1。

圖1 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果(×200)

圖2 丹皮酚對(duì)AMI大鼠IκB蛋白表達(dá)的影響(DAB,×400)

圖3 丹皮酚對(duì)AMI大鼠NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響(DAB，×400)

組別P-I-κBNF-κB假手術(shù)組0.7370±0.01892)0.7537±0.01952)模型組1.2569±0.03881)1.2779±0.03521)丹皮酚低劑量組1.0826±0.02441)2)1.1266±0.01931)2)丹皮酚中劑量組1.0057±0.01261)1.0126±0.01911)丹皮酚高劑量組0.8205±0.02081)0.9091±0.01831)卡托普利組0.7648±0.02171)0.8248±0.02021)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

NF-κB是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵因子之一，也是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，幾乎存在于所有細(xì)胞中。正常情況下，以二聚體形式和其抑制蛋白IκB結(jié)合以無(wú)活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)中，其最常見的形式是以p65和p50或p52蛋白亞基組成的二聚體，在細(xì)胞繁殖，抑制細(xì)胞凋亡以及天然免疫等許多細(xì)胞事件中都起著重要作用。相關(guān)研究證實(shí)，NF-κB在正常血管壁及心肌組織無(wú)表達(dá)或極少量表達(dá)，而在動(dòng)脈粥樣斑塊〔4～6〕、心肌梗死后的心肌組織以及心力衰竭的心肌組織中NF-κB活性明顯增高〔7，8〕。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組中NF-κB的蛋白表達(dá)顯著高于其他組，這與上述報(bào)道的結(jié)果一致。

AMI發(fā)生后，嚴(yán)重的缺血和缺氧導(dǎo)致大量的活性氧自由基 (ROS) 生成，而NF-κB作為一種應(yīng)激反應(yīng)因子，主要參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、調(diào)控相關(guān)炎性因子如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、腫瘤壞死因子(TNF)大量表達(dá)，導(dǎo)致心肌纖維的過(guò)度增生，間質(zhì)膠原的過(guò)度合成，而梗死后心室重構(gòu)時(shí)心肌間質(zhì)明顯增加,這是心室重構(gòu)由代償向失代償乃至心力衰竭的主要原因之一〔9〕。

MMP-9是MMPs 的一種，在病理情況下，酶原被激活，能特異性地降解胞外基質(zhì)，使心肌細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度纖維化從而促使心肌發(fā)生代償反應(yīng)出現(xiàn)心室重構(gòu)，導(dǎo)致心功能下降〔10〕。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物和人 NF-κB p65 結(jié)合于MMPs 基因 527 -519 位置堿基，上調(diào)了MMP-9的表達(dá)〔1〕，從而影響MMP-9對(duì)心室重構(gòu)的作用。本實(shí)驗(yàn)Masson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織確實(shí)出現(xiàn)了大量的膠原沉積，可能是由于NF-κB的過(guò)度活化使得炎性因子大量表達(dá)，從而出現(xiàn)嚴(yán)重的病理改變。樊冬梅〔1〕實(shí)驗(yàn)中還報(bào)道了，AMI后機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)刺激白細(xì)胞介素(IL)-1β、TNF等激活 NF-κB的誘導(dǎo)激酶(NIK)，促使 IκB 磷酸化降解，使得NF-κB 與IκB發(fā)生解離，被活化后由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核發(fā)揮調(diào)控作用。而激活的 NF-κB 又能與TNF-α、IL-6、IL-1β基因上特定靶序列相結(jié)合加強(qiáng)其表達(dá)，使 TNF-α、IL-1β合成增加；而自身表達(dá)增多且活化的炎癥因子又進(jìn)一步激活NF-κB，形成炎癥反應(yīng)的循環(huán)效應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)化和擴(kuò)大化，加速了心肌梗死后心室重構(gòu)的發(fā)展；張軍等〔11，12〕在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了NF-κB 被激活進(jìn)入胞核后，通過(guò)增強(qiáng)TNF-α、IL-1β 以及TGF-β1 等炎性因子的表達(dá)， 從而加強(qiáng)對(duì)炎癥反應(yīng)的正反饋?zhàn)饔谩Ｃ庖呓Y(jié)果顯示，大鼠梗死4 w后，模型組中p- IκB 及NF-κB的蛋白表達(dá)確實(shí)有顯著增強(qiáng)，且NF-κB在胞核中有大量的表達(dá)，Masson染色中，間質(zhì)膠原的大量增生均證實(shí)了炎癥反應(yīng)的循環(huán)效應(yīng)使得心肌出現(xiàn)重構(gòu)，心功能嚴(yán)重受損。

本研究表明丹皮酚對(duì)AMI后受損的心肌有明顯的保護(hù)與修復(fù)作用。丹皮酚能夠降低AMI后心肌組織中p-IκB的活化進(jìn)而抑制NF-κB的活性，降低了相關(guān)的炎癥反應(yīng)，減輕了心室重構(gòu)的發(fā)生。

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〔2015-06-26修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.C2011406009)

周曉慧(1958-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管藥理學(xué)研究。

趙靜怡(1985-)，女，碩士，主要從事心血管藥理學(xué)研究。

R541

A

1005-9202(2017)01-0022-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.009

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科