趙 晶,陳曼玉,李 磊

(大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

膽酸鹽外排泵研究的最新進(jìn)展

趙 晶,陳曼玉,李 磊

(大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

膽酸鹽外排泵是肝細(xì)胞分泌膽酸鹽進(jìn)入膽汁的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，其變異和功能抑制與許多膽汁淤積癥和藥致肝損傷有關(guān)。對(duì)這些疾病的分析總結(jié)加深了我們對(duì)膽酸鹽外排泵(bile salt export pump，BSEP)生理和病理功能的認(rèn)識(shí)，該文將對(duì)BSEP的結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控、底物及抑制劑，及其相關(guān)疾病進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，以期為臨床相關(guān)疾病的治療提供進(jìn)一步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

膽酸鹽外排泵；膽汁淤積；抑制劑；調(diào)控；膽汁酸; 調(diào)節(jié)因子

膽汁持續(xù)不斷的分泌進(jìn)入十二指腸對(duì)于脂類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和脂溶性維生素的吸收具有重要作用。在腸道中，膽酸鹽會(huì)被重新吸收經(jīng)肝門靜脈返回肝臟；然后通過(guò)肝細(xì)胞血管側(cè)膜的牛磺膽酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)多肽吸收進(jìn)入肝細(xì)胞，而進(jìn)入肝細(xì)胞的膽酸鹽又會(huì)被肝細(xì)胞膽管側(cè)膜的膽酸鹽外排泵(bile salt export pump，BSEP)分泌進(jìn)入膽管，并進(jìn)入膽囊貯存；在食物的刺激下膽酸鹽再次進(jìn)入十二指腸，如此周而復(fù)始，不斷循環(huán)。在這個(gè)循環(huán)過(guò)程中，BSEP介導(dǎo)的外排是膽酸鹽分泌的限速步驟，對(duì)BSEP的抑制可導(dǎo)致膽酸鹽在肝內(nèi)蓄積達(dá)到中毒水平，從而導(dǎo)致膽汁淤積和藥致肝損傷，并會(huì)間接影響人體血糖穩(wěn)態(tài)[1]，造成動(dòng)脈粥樣硬化[2]，甚至引起癌變[3]。鑒于BSEP在維持體內(nèi)膽酸鹽平衡中的重要作用，歐洲醫(yī)藥管理局(European Medicines Agency，EMA)已將其列入研究藥物相互作用的指南中。因此，對(duì)BSEP結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控的研究引起人們極大的關(guān)注。

1 BSEP的結(jié)構(gòu)

BSEP的基因符號(hào)為ABCB11，屬于ATP-結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)家族中的一員。BSEP與P-糖蛋白家族具有49%～50%氨基酸序列同源性， ABCB11基因包含有28個(gè)外顯子，定位于人染色體2q24位點(diǎn)。人BSEP由1 321個(gè)氨基酸組成，分子量為160 kDa[4]。BESP含有12個(gè)跨膜螺旋區(qū)域(Fig 1)。N-端和C-端均位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)，序列分析顯示在第1個(gè)細(xì)胞外環(huán)有4個(gè)N-端糖基化位點(diǎn)，在BSEP的穩(wěn)定及功能上扮演著重要的角色。

Fig 1 Schematic view of topological arrangement of BSEP

2 BSEP的表達(dá)與調(diào)控

BSEP主要分布于肝細(xì)胞膽管側(cè)膜，盡管有報(bào)道在其它組織中檢測(cè)到低水平的BSEP mRNA，但從未在蛋白水平上檢測(cè)到。細(xì)胞內(nèi)新合成的BSEP會(huì)經(jīng)高爾基體中轉(zhuǎn)運(yùn)至近細(xì)胞膜頂側(cè)的囊泡室(內(nèi)涵體)中。在最終轉(zhuǎn)運(yùn)到頂側(cè)膜之前，BSEP將在其中停留數(shù)小時(shí)。BSEP/Bsep(BSEP表示人體內(nèi)蛋白，Bsep表示動(dòng)物體內(nèi)蛋白)在頂側(cè)膜上的停留半衰期為4～6 d，其在頂側(cè)膜和近頂側(cè)囊泡室之間不斷的往復(fù)循環(huán)[5]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BSEP/Bsep的循環(huán)具有微管依賴性，對(duì)肌動(dòng)蛋白抑制劑敏感。另外也有一些蛋白能夠錨定在Bsep的作用位點(diǎn)上，對(duì)其產(chǎn)生影響，如肌球蛋白II的調(diào)控輕鏈(myosin Ⅱ regulatory light chain，MLC2)能夠與Bsep的核苷結(jié)合區(qū)域相互作用，對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)至漿膜側(cè)具有重要作用。MLC2的抑制劑Blebbistatin可使MLC2處于非磷酸化形式，從而會(huì)降低BSEP在漿膜側(cè)的表達(dá)水平[6]。

研究表明，在膽酸鹽高負(fù)荷時(shí)，大鼠肝臟的分泌能力會(huì)迅速上調(diào)。因此，BSEP表達(dá)的增加是一種急性調(diào)節(jié)方式，可促使膽酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)量迅速增加。這其中，磷脂酰肌醇-3激酶介導(dǎo)的磷酸肌醇脂磷酸化可能參與了BSEP轉(zhuǎn)運(yùn)活性的調(diào)節(jié)。另外，BSEP也存在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制。低滲和糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)BSEP mRNA表達(dá)水平的上調(diào)，而高滲作用則相反。細(xì)胞的低滲狀態(tài)能夠刺激膽酸的分泌可能跟Erk-1/2和p38 MAP激酶的激活有關(guān)。雌二醇-17β-葡糖苷酸，lithocholate，脂多糖等可導(dǎo)致Bsep內(nèi)化返回進(jìn)入頂側(cè)膜附近的囊泡室[7-8]。

人類的BSEP表達(dá)水平存在著明顯的個(gè)體差異，其表達(dá)水平受轉(zhuǎn)錄機(jī)制的高度調(diào)控[9]。BSEP/Bsep的主要調(diào)節(jié)器是法尼醇X受體(Farnesoid X receptor, FXR)。FXR/Fxr能夠激活人和動(dòng)物BSEP/Bsep的近端啟動(dòng)子。膽酸即是FXR的生理受體，能夠調(diào)節(jié)自身對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄。Fxr對(duì)于Bsep表達(dá)的關(guān)鍵作用可以通過(guò)Fxr基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)證明，給予此種小鼠膽酸鹽不能誘導(dǎo)Bsep的表達(dá)。

BSEP除了受FXR調(diào)節(jié)外，許多其它轉(zhuǎn)錄因子也參與其中(Fig 2)。例如，BSEP啟動(dòng)子活性受肝細(xì)胞特異性受體LRH-1的誘導(dǎo)，在Lrh1基因敲除小鼠肝中Bsep的表達(dá)會(huì)降低；BSEP啟動(dòng)子也受核調(diào)節(jié)因子NRF2的調(diào)節(jié)，NRF2在氧化應(yīng)激響應(yīng)中有重要作用[10]。

3 底物與抑制劑

盡管與P-gp同屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族，但BSEP對(duì)底物的選擇性很高，僅有一小部分P-gp底物可被其轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，BSEP并不外排P-gp底物長(zhǎng)春新堿、正定霉素、紫杉醇、地高辛和羅丹明123，但轉(zhuǎn)運(yùn)普伐他汀、長(zhǎng)春花堿等藥物[11]。BSEP對(duì)人膽汁中的主要膽酸鹽類物質(zhì)如甘氨鵝脫氧膽酸鈉，甘膽酸鹽和?；蛆Z膽酸鹽等具有很高的親和性。BSEP主要負(fù)責(zé)單價(jià)膽酸鹽的外排，多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP2則主要負(fù)責(zé)二價(jià)膽酸、硫酸化或葡糖醛酸化膽酸鹽的外排。另外，多藥耐藥蛋白MDR3負(fù)責(zé)將磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞微管膜的外側(cè)，而異質(zhì)二聚體ABCG5/ABCG8轉(zhuǎn)運(yùn)體則負(fù)責(zé)將膽固醇外排出去，所有這些轉(zhuǎn)運(yùn)體促成了包含有膽酸、膽固醇和磷脂成分的混合膠束的形成，從而對(duì)膽酸鹽可能對(duì)膽管細(xì)胞產(chǎn)生的“去垢危害”產(chǎn)生防護(hù)作用。

對(duì)BSEP的抑制將導(dǎo)致微管膜膽酸鹽分泌的減少，從而造成膽汁阻塞形成肝損傷。藥物誘導(dǎo)的肝損傷臨床上很常見(jiàn)，嚴(yán)重的時(shí)候甚至不得不進(jìn)行肝移植[12]。臨床上藥物導(dǎo)致肝損傷有30%的比例跟膽汁阻塞有關(guān)[13]。通過(guò)給予肝損傷患者BSEP抑制劑來(lái)評(píng)估BSEP在多大程度上起作用是非常困難的，因?yàn)橛袝r(shí)藥物的代謝產(chǎn)物會(huì)造成肝管上皮細(xì)胞的損傷。利用表達(dá)Bsep的Sf9體外細(xì)胞模型可以對(duì)藥物對(duì)Bsep的抑制作用進(jìn)行研究，并且其計(jì)算得到的Ki值與在大鼠微管膜上計(jì)算得到的Ki值具有可比較性。利用表達(dá)BSEP的昆蟲(chóng)細(xì)胞也證實(shí)了環(huán)孢素A、利福平、格列苯脲等對(duì)人BSEP有競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。Tab 1列舉了不同抑制劑對(duì)Bsep的抑制情況。

Fig 2 Regulation of bile salt export pump(BSEP) promoter

Bile acids(BA) are major regulators of BSEP expression through activation of the farnesoid X receptor(FXR). The activating complex ASCOM is recruited by BA/FXR for the methylation(Me) of histones within the BSEP promoter. The nuclear factor erythroid 2-related factor 2(NRF2) is activated by oxidative stress, binds to a Maf recognition element(MARE) and transactivates the BSEP promoter. The steroid receptor coactivator-2(SRC2) is activated by the liver kinase B1(LKB1) and the “energy sensor kinase” AMP activated protein kinase(AMPK) and activates gene expression via acetylation(Ac) of histones. Liver receptor homolog 1(LRH1) transactivates BSEP and CYP7A1, the rate-controlling enzyme of BA synthesis. Increased BSEP transcription eventually increases BSEP protein expression and removal of intracellular BA.(FXRE: FXR response element; LRHRE: LRH response element; NTCP: Na+-taurocholatecotransporting polypeptide; ROS: reactive oxygen species; RXR: Retinoid X receptor)

Tab 1 The inhibitor of Bsep in different expression system

4 BSEP相關(guān)疾病

4.1 膽汁酸對(duì)BSEP表達(dá)的調(diào)節(jié) BSEP的變化與肝對(duì)藥物消除、肝內(nèi)膽汁酸水平、膽汁流量的變化、膽結(jié)石形成敏感性有關(guān)。BSEP缺乏可導(dǎo)致：① 血中膽汁酸升高；② 膽汁中磷脂成分增高，與膽汁酸上調(diào)mdr2有關(guān)；③ 膽汁酸羥化增加，水溶性增強(qiáng)，即膽汁酸通過(guò)孕烷受體X (pregenane X receptor，PXR)途徑使四羥膽酸生成增加，羥基越多膽汁酸水溶性越大。后兩種改變和機(jī)體的代償有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)BSEP啟動(dòng)子有一個(gè)高度保守的IR1序列，該序列是公認(rèn)的FXR/ RXR的結(jié)合點(diǎn)。只有FXR和膽汁酸的結(jié)合，才能誘導(dǎo)BSEP啟動(dòng)子表達(dá)。FXR的膽汁酸結(jié)合區(qū)突變時(shí)，F(xiàn)XR不能激活BSEP啟動(dòng)子。FXR(-/-)鼠不能有效地調(diào)節(jié)膽汁酸合成和BSEP表達(dá)，其BSEP mRNA為正常鼠的70%，高膽酸喂食也不能誘導(dǎo)BSEP的表達(dá)。

在膽汁酸代謝調(diào)節(jié)中，F(xiàn)XR起著中心作用，F(xiàn)XR通過(guò)抑制CYP7A1和NTCP從而抑制膽汁酸合成及肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸的攝取，F(xiàn)XR對(duì)BSEP的激活加速了膽汁酸分泌，避免了肝內(nèi)膽汁酸堆積。FXR的激動(dòng)劑或抑制劑將用于高脂血癥和膽汁淤積的治療[24]。

4.2 膽汁淤積與BSEP突變 ABCB11的突變會(huì)導(dǎo)致蛋白分子功能的缺失，干擾BSEP正確進(jìn)入肝細(xì)胞膽小管膜，導(dǎo)致膽汁流量減少和膽酸鹽在肝細(xì)胞中的聚集，從而造成肝損傷，至少3種臨床肝臟疾病與此相關(guān)：II型良性復(fù)發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積(benign recurrent intrahepatic cholestasis Ⅱ，BRIC2)、Ⅱ型進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積(progressive familial intrahepatic cholestasis Ⅱ，PFIC2)和妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)。PFIC2是一種染色體遺傳病，表現(xiàn)為進(jìn)行性膽汁分泌障礙，膽汁中膽酸含量降低，血膽固醇正?；蚪档??；蚍治霰砻鳎琍FIC2患者家族成員的ABCB11基因序列出現(xiàn)突變，引起其編碼蛋白BSEP異常。到目前為止，發(fā)現(xiàn)了100多個(gè)錯(cuò)義(非同義)ABCB11基因的突變導(dǎo)致嚴(yán)重PFIC2。這些突變產(chǎn)生非功能性蛋白或?qū)е聸](méi)有蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，都與PFIC2相關(guān)。

由于許多ABCB11基因的突變影響B(tài)SEP的功能活性或表達(dá)，并且增強(qiáng)了藥物誘導(dǎo)膽汁郁積的敏感性，因此從體外BSEP抑制結(jié)果預(yù)測(cè)膽汁郁積和藥物誘導(dǎo)肝損傷非常困難[25-27]。應(yīng)用免疫組化方法測(cè)定28例PFIC2病人的肝組織，發(fā)現(xiàn)其中16例病人肝細(xì)胞膽小管側(cè)膜的BSEP表達(dá)為陰性，且均存在基因突變，病人膽汁中膽酸鹽濃度小于正常的1%。應(yīng)用熊脫氧膽酸進(jìn)行治療，不能恢復(fù)BSEP，且膽汁中不能檢測(cè)到熊脫氧膽酸。與人類不同，小鼠BSEP基因突變后總膽汁酸鹽含量降低4倍，血漿和肝臟膽汁酸鹽則分別增高5.8倍和4倍。但其膽汁中可檢測(cè)到人體罕見(jiàn)的四羥基膽汁酸，提示小鼠肝細(xì)胞膽小管側(cè)膜可能存在替代轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，分泌四羥基膽汁酸來(lái)減輕對(duì)肝細(xì)胞的毒性。人體由于缺乏這種替代途徑，導(dǎo)致病情進(jìn)行性地加重。

有研究顯示，BSEP的突變也可能參與膽固醇結(jié)石病的發(fā)生。Bsep突變小鼠肝臟分泌膽汁酸鹽減少，而膽汁中膽固醇和磷脂的含量明顯升高，這種改變可能達(dá)到易于成石的狀態(tài)，使膽汁中膽固醇飽和度升高。

4.3 BSEP與肝癌的關(guān)系 膽汁分泌對(duì)于維持肝臟的正常生理代謝功能至關(guān)重要, 若膽汁形成或分泌出現(xiàn)問(wèn)題, 將對(duì)肝臟造成炎癥性的損傷，甚至產(chǎn)生致癌作用。Wang等[28]用基因敲除的小鼠來(lái)考察轉(zhuǎn)運(yùn)體與肝癌發(fā)生的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Bsep基因敲除小鼠肝癌的發(fā)病率極低，推測(cè)原因可能與Mdr1、Mrp3和Mrp4代償性增多有關(guān)。BSEP功能缺陷可顯著提高肝臟惡性腫瘤的發(fā)病率，有研究表明，15%的BSEP功能缺陷患者可發(fā)展為肝癌或膽管上皮癌[29-30]。

4.4 BSEP與藥物誘導(dǎo)的肝損傷 藥物誘導(dǎo)的肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)在臨床上很常見(jiàn)，嚴(yán)重的時(shí)候甚至不得不進(jìn)行肝移植。由于BSEP是一個(gè)能量依賴性蛋白，負(fù)責(zé)膽汁酸從肝細(xì)胞的流出，可以認(rèn)為當(dāng)人服用同時(shí)使線粒體能量和BSEP功能活性損傷的藥物時(shí)，能表現(xiàn)出比單一損傷更為嚴(yán)重的DILI的臨床反應(yīng)[28]。臨床上藥物導(dǎo)致肝損傷有30%的比例跟膽汁阻塞有關(guān)。例如，曲格列酮作為一種胰島激素類藥物因?yàn)槠涓味拘远怀烦鍪袌?chǎng)。有研究顯示其肝毒性與膽汁淤積有關(guān)。曲格列酮和它的硫酸結(jié)合物(曲格列酮膽汁排泄的主要代謝物)競(jìng)爭(zhēng)性抑制由BSEP介導(dǎo)的?；悄懰猁}能量依賴性的轉(zhuǎn)運(yùn)。這種對(duì)膽鹽泵出的抑制造成人肝中膽汁淤積，從而產(chǎn)生肝毒性。對(duì)大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，曲格列酮和其硫酸結(jié)合物均能抑制BSEP，Ki值分別為1.3和0.23 μmol·L-1。♂大鼠體內(nèi)曲格列酮硫酸結(jié)合物的濃度比♀大鼠的濃度高(因?yàn)椤岽笫蟮幕撬徂D(zhuǎn)移酶活性較高)，因而給予曲格列酮后♂大鼠將出現(xiàn)比♀大鼠更為嚴(yán)重的膽汁淤積。

5 總結(jié)與展望

BSEP在肝微管膽酸鹽的分泌中起著決定性的作用，其病變和功能抑制與多種膽汁淤積癥密切相關(guān)。BSEP轉(zhuǎn)運(yùn)體在正常的肝細(xì)胞中調(diào)節(jié)膽酸鹽平衡，當(dāng)BSEP活性受損后會(huì)造成膽汁淤積和藥物誘導(dǎo)的肝毒性，這些充分表明體外評(píng)價(jià)BSEP與藥物相互作用的重要性，因此對(duì)BSEP轉(zhuǎn)運(yùn)的評(píng)價(jià)方法成為研究的熱點(diǎn)[28]。目前，很多公司已經(jīng)將BSEP抑制劑合并入藥物發(fā)現(xiàn)的篩選程序中，即用體外測(cè)定方法來(lái)評(píng)價(jià)藥物或化學(xué)實(shí)體作為BSEP的底物或抑制劑的潛力。膜囊泡和基于肝細(xì)胞的BSEP測(cè)定是目前用于藥物或藥物候選物篩選的最主要的方法。相對(duì)于其它試驗(yàn)方法，BSEP膜囊泡測(cè)定相對(duì)容易實(shí)施，對(duì)于底物/抑制劑的測(cè)定和動(dòng)力學(xué)分析也是確證有效的。采用這種方法可以研究由BSEP引起的藥物相互作用，同時(shí)在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中有利于大量化合物的的高通量篩選[28]。但是采用膜囊泡體系缺乏實(shí)驗(yàn)化合物的在體代謝，這有可能會(huì)影響B(tài)SEP抑制，因此當(dāng)將測(cè)定結(jié)果外推到體內(nèi)時(shí)有可能會(huì)造成誤導(dǎo)。對(duì)BSEP結(jié)構(gòu)功能、抑制劑及基因變異的詳細(xì)研究方法可加深人們對(duì)膽汁形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)，開(kāi)發(fā)出新的相關(guān)疾病治療策略。

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The research progress of bile acid efflux pump (BSEP)

ZHAO Jing, CHEN Man-yu, LI Lei

(CollegeofPharmacy,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Bile acid efflux pump(BSEP) is the major transporter of bile salts secreted by liver cells into the bile, the variation and inhibition of which are connected with cholestasis and drug-induced liver injury. A deep understanding of the physiological and pathological function of BSEP IS achieved by analysis and summary of diseases. The paper briefly illustrates the structure, expression, regulation, substrates, inhibitors and diseases of BSEP, in order to provide further theoretical and experimental basis for the clinical treatment.

BSEP; cholestasis; inhibitor; regulation; bile acid； regulatory factor

時(shí)間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.008.html

2016-08-21;

2016-11-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81202484)

趙 晶(1992-)，女，碩士生，研究方向：藥物傳遞系統(tǒng)，Tel: 0411-86110420, E-mail: zhaoj0109@163.com; 李 磊(1976-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物傳遞系統(tǒng)，通訊作者，Tel: 0411-86110420, E-mail:ll_wht@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.004

A

1001-1978(2017)01-0018-05

R-05；R322.47；R394.2；R575；R735.7