王 惠， 馮 媛， 王崇剛

我國是面臨細菌耐藥性威脅最為嚴重的國家之一。在所有耐藥病原體中，糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬細菌（ESKAPE）占醫(yī)院感染的大多數(shù)，且耐藥率持續(xù)增長[1]。根據(jù)2017年CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)表明革蘭陰性菌檢出率約占70%[2]，其耐藥性日趨嚴重。抗藥性起源多且復(fù)雜，而多藥耐藥通常與外排泵相關(guān)。革蘭陰性菌以多種方式適應(yīng)抗菌藥物的選擇壓力，包括外排泵的（過）表達。目前，已經(jīng)鑒定了6類外排泵家族[3]，包括僅存在于革蘭陰性菌的抗性-結(jié)瘤-細胞分裂（RND）超家族[4]，外排泵RND家族參與細菌的生理、代謝及致病[5-6]，并在介導(dǎo)多藥耐藥中發(fā)揮重要作用。本文主要介紹臨床常見革蘭陰性菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌外排泵的結(jié)構(gòu)、生理功能及在生物膜形成中的作用等最新進展，為外排泵抑制劑的研發(fā)提供新思 路。

1 外排泵結(jié)構(gòu)

RND轉(zhuǎn)運蛋白家族由蘑菇狀同源三聚體的內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白（IMP）、漏斗狀六聚體的周質(zhì)融合蛋白（MFP）和同源三聚體的外膜外排蛋白（OEP）組成。MFP位于周質(zhì)空間橋接IMP和OEP，IMP利用質(zhì)子梯度通過質(zhì)子/底物反轉(zhuǎn)運機制驅(qū)動底物排入到OEP中。以下將分別闡述3種細菌的外排泵RND家族結(jié)構(gòu)。

1.1 大腸埃希菌

RND超家族的AcrAB-TolC復(fù)合體是大腸埃希菌的主要外排泵[7]，該泵組件包括外膜通道蛋白TolC，位于內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運蛋白AcrB和周質(zhì)蛋白融合蛋白AcrA。外排泵各個亞基之間相互作用且在泵內(nèi)組織，直到AcrAB-TolC復(fù)合物的第一個偽原子結(jié)構(gòu)（pseudo-atomic structure）公布[8]，泵的整體形狀以及其組成的相對排列，通過電子顯微鏡研究得以揭示[9-10]，詳細描述了處于靜止狀態(tài)和藥物傳輸狀態(tài)完整的AcrAB-TolC組裝以及相關(guān)的三級和四級結(jié)構(gòu)變化[11]。正如Du等[8]提出，AcrB與TolC之間沒有直接的相互作用，但AcrA與兩者都分別作用。近期研究通過低溫電子斷層掃描術(shù)（cryo-ET）證實了AcrAB-TolC外排泵的結(jié)構(gòu)，提出在存在抗生素的情況下，AcrAB復(fù)合體通過改變其構(gòu)象募集TolC[12]。肽聚糖在AcrAB-TolC的組裝過程中起重要作用，AcrA的α-發(fā)夾結(jié)構(gòu)域與肽聚糖結(jié)合有助于維持AcrAB復(fù)合體在細胞包膜中的穩(wěn)定性，同時當 AcrB與底物結(jié)合時有助于TolC與AcrAB復(fù)合體連接，證實了AcrAB-TolC泵的結(jié)構(gòu)及其在天然細胞膜環(huán)境中的中間組裝狀態(tài)，提出可以通過干預(yù)AcrA與肽聚糖或AcrB之間的相互作用而阻斷AcrAB-TolC的組裝。

1.2 銅綠假單胞菌

迄今已知，銅綠假單胞菌中至少存在12種RND型，MexAB-OprM和MexXY-OprM是細菌在感染機體過程中存活和產(chǎn)生固有耐藥性的主要外排系統(tǒng)[13]。MexAB-OprM是與大腸埃希菌AcrABTolC同源的系統(tǒng)，由內(nèi)膜蛋白MexB、外膜蛋白OprM和周質(zhì)膜融合蛋白MexA三部分組成。AcrB和MexB的氨基酸序列同源性為70%，AcrA和MexA的同源性為57%，TolC和OprM的同源性為19%[14]。過去認為MFP和IMP形成高度特異性結(jié)合，不允許同源泵之間相互交換。例如，MexA和MexB在功能上不能與該菌中的任何其他多藥耐藥外排泵系統(tǒng)互換[15]，然而已有研究報道MexB與AcrA和TolC的功能相互作用，Daury等[10]發(fā)現(xiàn)組裝過程中將MexB與AcrB互換時，可組裝AcrAMexB-TolC復(fù)合物，但與原復(fù)合物的形成相比發(fā)生率較低，提出可能存在通用的機制觸發(fā)外排泵的組裝，形成效率取決于MFP的結(jié)合親和力，由此可通過阻止蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)識別或通過阻礙其結(jié)構(gòu)適應(yīng)性影響泵效率，為外排泵抑制劑提供新思路。Lopez等[16]對MexA-OprM組裝研究發(fā)現(xiàn)，OprM需要與MexA組裝成藥物結(jié)合樣構(gòu)象才能打開OprM周質(zhì)孔，同樣也需要通過周質(zhì)結(jié)構(gòu)域和外部結(jié)構(gòu)域之間的相互作用來介導(dǎo)MexB開放并使整個泵正常工作。最近Tsutsumi 等[17]研究也證實OprM與MexA具有協(xié)同作用，通過開放周質(zhì)孔而被激活。該團隊構(gòu)建完整的MexAB-OprM泵模型，提出MexA-MexB復(fù)合物比MexA-OprM復(fù)合物更穩(wěn)定，并且MexA可能在OprM之前與MexB形成復(fù)合物，目前尚需要進一步的動態(tài)結(jié)構(gòu)研究[例如分子動力學(xué)（MD）模擬]予以驗證。

1.3 鮑曼不動桿菌

耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌在我國分離率最高可達90%[2]。鮑曼不動桿菌RND家族主要外排泵是AdeABC、AdeFGH和AdeIJK。Su等[18]研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)分子在AdeB三聚體的內(nèi)部表面形成一個環(huán)并結(jié)合在細胞質(zhì)膜小葉上，其可能參與了AdeB三聚體的穩(wěn)定作用，該研究還提出質(zhì)子的流入和藥物的流出在轉(zhuǎn)運周期內(nèi)是相互協(xié)調(diào)并同步進行 的。

2 外排泵的生理功能

2.1 外排泵介導(dǎo)的固有耐藥

細菌固有耐藥是指其通過固有的結(jié)構(gòu)或功能特性降低特定抗生素功效的能力[19]，RND外排泵家族是革蘭陰性菌多藥耐藥的重要原因，如AcrAB-TolC外排泵具有底物廣泛的特異性，能夠排出多種化合物，包括β內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、利福平類抗菌藥物等[20]。AdeABC外排泵系統(tǒng)介導(dǎo)了對多種抗菌藥物的抗藥性，過去研究認為臨床分離株中的多藥耐藥表型是由于其過表達引起的，如Yoon等[21]在具有免疫功能的小鼠全身及肺部感染模型中，對鮑曼不動桿菌體內(nèi)適應(yīng)性和毒力進行了評估，僅在腹膜內(nèi)接種后才觀察到過表達AdeABC鮑曼不動桿菌在宿主中的適應(yīng)性降低，而在鼻內(nèi)接種后則沒有觀察到，表明鼻內(nèi)感染對小鼠更具毒性并刺激增強肺中性粒細胞活化，該研究解釋了呼吸機相關(guān)性肺炎常見于AdeABC外排泵過表達的原因。但近期研究證明外排泵在抗生素耐藥性中的作用更為復(fù)雜并取決于特定的生理環(huán)境，外排泵對鮑曼不動桿菌的耐藥性作用僅限于少數(shù)幾種抗生素，并且流出泵過量生產(chǎn)對抗生素敏感性的影響是明顯低于先前報道的臨床分離株[22-23]，表明涉及額外的抗性機制，特別是改善細菌細胞的滲透屏障并與主動外排泵協(xié)同作用的機制[24]。

近年有文獻報道外排泵表達在細胞間差異的重要性[20，25]。例如，在大腸埃希菌中，AcrAB-TolC泵異質(zhì)分配，泵聚集在舊極點，表現(xiàn)出對母代細胞的偏倚，導(dǎo)致外排泵表達較高的細胞亞群中的抗性水平升高[25]。RND外排泵在慢性細菌感染中也發(fā)揮重要作用，Pu等[20]發(fā)現(xiàn)編碼外排泵的基因包括tolC、acrA和acrB，在持留菌中表達更高，且主動外排要先于主動休眠，同時進一步證實了TolC表達與細菌持久性生存呈正相關(guān)，而這種瞬時抗藥性機制在持留菌頑固性和反復(fù)感染中起關(guān)鍵作用。

2.2 外排泵介導(dǎo)的獲得性耐藥

細菌可以通過瞬時耐藥機制使細菌暫時耐藥，即細菌通過休眠進行“被動防御”、利用外排泵來泵出抗生素進行“主動防御”，也可以通過基因突變或水平基因轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因[26]，從而增加細菌在抗生素應(yīng)用下的適應(yīng)性。耐藥性的獲得極大地促進了多重耐藥菌株的產(chǎn)生，增加了抗感染治療的難度。

2.2.1 基因突變 研究發(fā)現(xiàn)細菌耐受性（tolerance）要先于耐藥性，在持久性狀態(tài)下，耐受細胞抗性基因突變概率增加[27]，其機制與外排泵相關(guān)：大腸埃希菌AcrAB-TolC水平升高導(dǎo)致DNA錯配修復(fù)基因mutS表達降低，MutS降低會造成錯配修復(fù)（MMR）和短補丁修復(fù)（VSP）系統(tǒng)功能缺陷或降低，同時MutS可抑制RecA介導(dǎo)的鏈轉(zhuǎn)移，mutS表達降低的細胞在種間雜交中重組增加[28]。Ei Meouche等[29]發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌AcrABTolC外排泵表達水平較高的細胞具有DNA錯配修復(fù)基因mutS表達較低、生長速率降低以及突變頻率增加。證實了AcrAB外排泵表達升高引起的瞬時抗藥性可以促進單個細胞內(nèi)的自發(fā)突變，表明細胞間外排泵表達異質(zhì)性除了在瞬時抗藥性中產(chǎn)生差異，還會導(dǎo)致自發(fā)突變率的差異。目前尚不清楚mutS是由AcrAB-TolC直接調(diào)控，還是AcrAB調(diào)控或兩者共同調(diào)控。

2.2.2 基因水平轉(zhuǎn)移 細菌耐藥性的傳播主要方式是耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，最常見的是從環(huán)境中其他細菌獲得的染色體外元件，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等。Nolivos等[30]利用熒光顯微鏡成像系統(tǒng)觀察大腸埃希菌在單細胞水平質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，該質(zhì)粒攜帶有編碼TetA外排泵（主動外排四環(huán)素）的tet操縱子及調(diào)節(jié)tetA表達的TetR阻遏物。研究發(fā)現(xiàn)在四環(huán)素存在的情況下，（36.2±12.5）%敏感受體菌株仍可獲得四環(huán)素耐藥性，表明盡管四環(huán)素對蛋白質(zhì)合成有抑制作用，但獲得質(zhì)粒后受體菌仍可合成TetA外排泵。進一步研究發(fā)現(xiàn)AcrAB-TolC外排泵能有效降低敏感菌中四環(huán)素的濃度，確保從新獲得的質(zhì)粒中合成TetA泵。該團隊同時檢測了其他底物如利福平（抑制轉(zhuǎn)錄）和氯霉素或紅霉素（抑制翻譯）等，證實了AcrABTolc外排泵減輕藥物對F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移后耐藥基因表達的抑制作用，包括質(zhì)粒ssDNA轉(zhuǎn)化為dsDNA，抗性基因轉(zhuǎn)錄為mRNA以及蛋白質(zhì)合成。

2.3 外排泵在生物膜形成的作用

生物膜的形成在鮑曼不動桿菌感染宿主中起著重要作用，還導(dǎo)致醫(yī)療設(shè)備相關(guān)感染。多項研究發(fā)現(xiàn)與浮游狀態(tài)相比，形成生物膜狀態(tài)細菌的外排基因表達增加[31]，后者比前者對抗生素的耐受性高。研究表明外排泵的缺失或抑制與生物膜形成明顯減少有關(guān)[22]，生物膜是細菌耐藥的重要組成部分，外排泵在其形成中起到重要作用，一項研究表明RND超家族的AcrB和MdtABC泵有助于維持生物膜[32]。缺失acrB和mdtABC基因的突變株在4 h時可正常形成生物膜，隨著時間推移生物膜逐漸減少并在24 h內(nèi)明顯減少，實驗表明AcrB和MdtABC不參與外排生物膜形成所需的底物，但它們外排維持生物膜所必需的信號因子。 最近，Bay等[33]發(fā)現(xiàn)與野生株相比，缺乏acrB、acrA和tolC基因的大腸埃希菌突變株對生物膜生長有明顯抑制作用，并對抗菌藥物的敏感性更高。 He等[34]報道，鮑曼不動桿菌臨床分離株形成的生物膜與AdeFGH外排泵的過表達有關(guān)。

生物膜形成的調(diào)控主要取決于群體感應(yīng)系統(tǒng)，大部分革蘭陰性菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)是由雙組分LuxI/R型信號系統(tǒng)調(diào)控，該系統(tǒng)產(chǎn)生兩種主要AHL（N-?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯）信號分子，即3OC12-HSL（3-氧代十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯）和C4-HSL（N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯）。外排泵在生物膜形成所需的群體感應(yīng)信號分子運輸中發(fā)揮作用，一項經(jīng)典研究發(fā)現(xiàn)用疊氮化物（胞質(zhì)膜質(zhì)子梯度抑制劑）處理過的野生型銅綠假單孢菌細胞內(nèi)蓄積大量3OC12-HSL，此外，缺乏MexABOprM外排泵的銅綠假單胞菌突變體也顯示出3 OC12-HSL的細胞內(nèi)強蓄積性并減少了生物膜形成，這項研究表明3OC12-HSL是MexAB-OprM的天然底物并參與其外排[35]。另一項研究也證實分別編碼生物膜發(fā)育所需的AHL和AdeFGH外排泵的abaI和abeG基因上調(diào)，AdeFGH外排泵的過表達可能會加速AHL在生物膜形成期間的外排[36]。提示可使用外排泵抑制劑與抗菌藥物聯(lián)合，以減少致病菌在肺中的定植。

3 展望

外排泵RND家族對于革蘭陰性菌的生存至關(guān)重要，其參與細菌群體感應(yīng)、毒力及生物膜的形成、參與細菌耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移及基因突變、參與細菌瞬時和持久耐藥性等，因此外排泵抑制劑主要通過與競爭性抑制轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)合位點、干擾外排泵蛋白的組裝、阻斷供能效應(yīng)、抑制底物通過外排泵通道等機制，可恢復(fù)其對抗菌藥物敏感性、防止新的突變株出現(xiàn)以及減少生物膜形成。近年來外排泵抑制劑得到廣泛研究，例如吡喃吡啶、擬肽類和吲哚衍生物等[37-38]，到目前為止還沒有臨床獲批的外排泵抑制劑，主要原因是體內(nèi)藥效低、藥動學(xué)性質(zhì)差及毒性問題，同時細菌存在多種外排泵且底物廣譜，為開發(fā)有效的外排泵抑制劑帶來了難題。