任儀鵬 張 蕾 史悅怡 步榮發(fā)

人源化小鼠模型(Humanized Mouse Model)是指帶有功能性的人類基因、細(xì)胞或組織的小鼠模型。這種模型通常被用做人類疾病體內(nèi)研究(in vivo study)的活體替代模型。

口腔鱗癌的免疫治療[1]已經(jīng)是目前的研究熱點(diǎn)。雖然動物自身的免疫系統(tǒng)和人類存在相似點(diǎn)，但是區(qū)別也非常大。所以需要建立一種可以在一定程度上模擬人類免疫狀態(tài)的動物模型。這種模型介于動物模型和人體臨床試驗(yàn)之間，具有明確的免疫缺陷并允許人類免疫細(xì)胞在其體內(nèi)移植及擴(kuò)增。在以往的口腔鱗癌動物試驗(yàn)中最常使用的是缺少T細(xì)胞的裸鼠，可是在構(gòu)建人源化動物模型和進(jìn)行免疫相關(guān)研究方面卻并不可靠。SCID-beige鼠是一類免疫重度缺陷的小鼠，可用于人源化小鼠模型的建立。本研究的目的就在于建立人源化SCID-beige鼠模型并將其應(yīng)用于口腔鱗癌免疫研究之中，初步評估其建模效果。

1.材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物及細(xì)胞 SCID-beige鼠30只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司。4-5周齡，體重20g-25g，雌、雄性均可。在解放軍總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心無菌層流條件下飼養(yǎng)，水、食物及填料均高壓滅菌。飼養(yǎng)溫度22℃，濕度55%，12小時白/晝節(jié)律。整個實(shí)驗(yàn)的過程都需要在無菌條件下進(jìn)行。

腫瘤細(xì)胞系：為了評估的全面性，選用了三株常用的人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，TCA8113、SCC9、SCC25。

人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)：來源于解放軍總醫(yī)院輸血科健康獻(xiàn)血者外周靜脈血。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) TCA8113、SCC9、SCC25細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基(10%熱滅活新生牛血清，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)換液傳代。傳代及試驗(yàn)前需用0.25%胰蛋白酶溶液消化。

1.3 Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型的建立

1.3.1 分離人外周血淋巴細(xì)胞 全血常規(guī)操作分離成分血后，無菌提取剩余血液成分回實(shí)驗(yàn)室處理；血與淋巴細(xì)胞分離液按1∶2比例混合；1500r/min離心15min；用膠頭滴管先吸棄血漿層，再吸取白膜層至另一離心管中；加入生理鹽水至總量40-45ml并混勻后，300g離心10min洗去分離液；重復(fù)洗滌1次；計(jì)數(shù)細(xì)胞并用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度至3×107/200ul待用。

1.3.2 PBL小鼠腹腔注射 當(dāng)日新鮮分離的PBL細(xì)胞懸浮在生理鹽水中，按照100μl/10g(體重)的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)腹腔注射200μl，共3×107個/只。

1.3.3 免疫重建后小鼠外周血免疫球蛋白的測定 4周后取小鼠尾靜脈血，凝固后取血清。按照檢測人免疫球蛋白定量試劑盒(IgG)的操作說明操作。

1.4 皮下荷瘤模型的建立 取上一步驟中可以檢測出人IgG的小鼠，隨機(jī)分為三組：1、TCA8113組；2、SCC9組；3、SCC25組。每組10只。首先檢測三組IgG水平，分析沒有組間差異后繼續(xù)后續(xù)步驟。

收獲對數(shù)生長期的TCA8113、SCC9以及SCC25細(xì)胞，分別制成單細(xì)胞懸液，生理鹽水洗滌2次，臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)大于95%，用生理鹽水調(diào)整活細(xì)胞濃度為2.5×107/mL。將三種細(xì)胞懸液分別注射于小鼠背部皮下，每只小鼠注射100μL，即2.5×106個/只，無菌環(huán)境下飼養(yǎng)。密切觀察小鼠成瘤情況，當(dāng)腫瘤長至能測量后，每隔4日用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤長徑和短徑，用下列公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積(cm3)＝長徑×短徑2×1/2。于接種腫瘤細(xì)胞4-6周(如腫瘤生長快速可在4周后)，乙醚麻醉后，摘眼球放血處死，分別取三組小鼠的腫瘤組織進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用chiss2004軟件，進(jìn)行組間差異的方差分析，然后SNK檢驗(yàn)法進(jìn)行組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

2.結(jié)果

2.1 Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型的建立 全部小鼠外周血中均可檢測到human-IgG，濃度較高，平均達(dá)2.105g/L，成功建立了Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型(圖1)，重建成功率100%。對小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示組間IgG含量沒有差異(圖2)。

2.2 移植瘤模型的建立和腫瘤體積 分別將TCA8113、SCC9以及SCC25細(xì)胞于皮下接種小鼠，7-10d開始有瘤結(jié)節(jié)形成，成瘤率95%。之后腫瘤呈進(jìn)行性生長。測量腫瘤生長速度組間無明顯區(qū)別(圖3)。最終腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Tca8113組 2.858cm3±1.188cm3、SCC9組2.119cm3±1.032cm3、SCC25 組 2.693cm3±1.152cm3(圖4)。其中我們對TCA8113細(xì)胞移植瘤進(jìn)行了病理切片檢查，并與裸鼠移植瘤切片進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)沒有出現(xiàn)特異性改變(圖5)。

圖1 資料SCID-beige鼠(建立移植瘤模型后，腫瘤部位如箭頭所示)

圖2 ELISA法檢測小鼠體內(nèi)human-IgG含量，三組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

圖3 三組移植瘤生長趨勢相似

圖4 小鼠處死前測量腫瘤體積差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05

圖5 TCA8113細(xì)胞移植瘤形態(tài)無明顯差異

3.討論

以往的生命科學(xué)研究中最常使用的免疫缺陷模型是裸鼠，但是裸鼠體內(nèi)雖然缺少T細(xì)胞，可是卻具備有功能的B細(xì)胞和NK細(xì)胞，人類腫瘤可以成功移植到裸鼠,但是正常的人類細(xì)胞卻為裸鼠所排斥。而SCID小鼠因?yàn)轶w內(nèi)同時缺少T細(xì)胞和B細(xì)胞，從而成為了建立人源化動物模型的理想選擇。自從1988年Mosier成功報(bào)導(dǎo)了將人外周血單核細(xì)胞(PBMC)輸注給重度免疫缺陷鼠(SCID)鼠體內(nèi)，并檢測到人淋巴細(xì)胞的存在并具有生物學(xué)功能，后來，這種方法已廣泛應(yīng)用于癌癥生物學(xué)，自身免疫，變態(tài)反應(yīng)，傳染和移植生物學(xué)等方面研究。

雖然具備以上優(yōu)勢，但SCID小鼠象裸鼠一樣，其體內(nèi)還殘留有NK細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞等。并且在后天飼養(yǎng)過程中會重新出現(xiàn)免疫系統(tǒng)，也就是容易發(fā)生“免疫滲漏”。所以，為了使SCID小鼠固有的天生免疫系統(tǒng)失效，又將其與另外一種突變種小鼠beige鼠進(jìn)行雜交[2]。由此獲得的SCID/beige小鼠表現(xiàn)為T和B細(xì)胞功能缺陷且NK細(xì)胞功能和吞噬作用嚴(yán)重減弱[3]，其發(fā)生“免疫滲漏”的機(jī)率很低，且不會隨著鼠齡的增加而上升。

SCID/beige雙重突變型小鼠同時具有T/B細(xì)胞和先天性免疫系統(tǒng)缺陷，影響了NK細(xì)胞和吞噬細(xì)胞功能。因此，移植入小鼠體內(nèi)的人PBMC成功率大為提高，雖然人B細(xì)胞還不能出現(xiàn)在小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中，但是PBMC已經(jīng)能夠出現(xiàn)在淋巴器官中并且可以在血液中檢測到人IgG水平的表達(dá)。因此，SCID/beige成為了一種很好的可以在體內(nèi)進(jìn)行人類免疫系統(tǒng)研究及其它疾病研究的動物模型。

建立人源化免疫動物模型的方式也有很多種，主要的有兩種：(1)干細(xì)胞移植方式，這種方法雖然精確，但構(gòu)建模型較慢[4]；(2)移植完全分化的人外周血細(xì)胞的方式[5]。本研究中我們采用了第二種方法，不僅是因?yàn)槠淇焖贅?gòu)建人源化小鼠的快速方便，還因?yàn)檫@種方式可以更加準(zhǔn)確的反應(yīng)健康供者的免疫記憶狀態(tài)。

本研究中為了更加接近人體內(nèi)狀況，采用了SCID/beige鼠以及人PBL腹腔注射的方法來構(gòu)建hu-PBL-SCID-beige模型，模擬人的免疫環(huán)境。值得指出的是既往很多研究中小鼠重建免疫模型之前都要經(jīng)過預(yù)處理，如為尾靜脈注射抗NK細(xì)胞活性制劑，重建前進(jìn)行亞致死劑量的放射線照射等[6,7]。目的都是降低免疫滲漏的發(fā)生率，提高重建成功的比率，但是即使如此目前仍然有著較高的重建失敗率。將SCID-beige小鼠用于免疫重建則無需這些難以控制的步驟[8]。本研究同樣未采取重建前處理措施，最終構(gòu)建人源化小鼠免疫模型成功率100%，所有小鼠血液中均可檢測出人免疫球蛋白的表達(dá)，并且水平較高。成功建立了hu-PBLSCID-beige模型。接著又采用了三種較常見的人舌癌細(xì)胞系進(jìn)行腫瘤種植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示均可成功建立種植瘤模型。目前國內(nèi)外將人源化小鼠模型作為頭頸腫瘤研究動物模型的方法較少，本次實(shí)驗(yàn)為此領(lǐng)域的應(yīng)用和研究進(jìn)行了初步探索，為今后模擬人體免疫環(huán)境并研究OSCC及免疫治療方法提供了新的選擇和參考。

[1] 任儀鵬,步榮發(fā),張 蕾,等.腫瘤微環(huán)境中的相關(guān)免疫細(xì)胞[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2011,9(6):361-364

[2] Roder J,Duwe A.The beige mutation in the mouse selectively impairs natural killer cell function[J].Nature,1979,278(5703):451-453

[3] Mosier D E,Stell K L,Gulizia R J,et al.Homozygous scid/scid;beige/beige mice have low levels of spontaneous or neonatal T cell-induced B cell generation[J].Journal of Experimental Medicine,1993,177(1):191-194

[4] Lapidot T,Pflumio F,Doedens M,et al.Cytokine stimulation of multilineage hematopoiesis from immature human cells engrafted in SCID mice[J].Science,1992,255(5048):1137-1141

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[6] Jian-Hong W U,Zhang F,Zhao W,et al.Establishment and Identification of HU-PBL-SCID Mice Model of Human Bladder Cancer Model[J].Progress in Modern Biomedicine,2014

[7]Pearson T,Greiner D L,Shultz L D.Humanized SCID mouse models for biomedical research[J].Current Topics in Microbiology&Immunology,2008,324(324):25-42

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