聞超，包明威

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西羅莫司自乳化緩釋微丸的制備及對淋巴細(xì)胞的作用研究

聞超，包明威*

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院, 湖北 武漢 430060）

采用擠出滾圓法，以羥丙甲基纖維素鈉為主要骨架型緩釋材料制備出西羅莫司自乳化緩釋微丸，考察制備工藝中擠出速度、滾圓速度、滾圓時(shí)間對目標(biāo)速率影響并對淋巴細(xì)胞作用的研究。結(jié)果表明：西羅莫司自乳化緩釋微丸的目標(biāo)收率為（92.8±2.51）%（=3），采用擠出速度為擠出速度為65 r·min－1；滾圓速度為650 r·min－1；滾圓時(shí)間為3 min最適宜；西羅莫司緩釋微丸能夠抑制淋巴細(xì)胞的增值的活性，隨著時(shí)間增長，抑制作用增強(qiáng)。以上表明：采用該方法為西羅莫司緩釋微丸研究提供新的方法。

西羅莫司；自乳化給藥系統(tǒng)；微丸；制備工藝；淋巴細(xì)胞

西羅莫司，又名雷帕霉素，是從放線菌提取出來的一種三烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物[1]，目前臨床上廣泛應(yīng)用于預(yù)防器官移植病人的急性排斥反應(yīng)，這是由于與其他免疫抑制劑相比腎毒性和神經(jīng)毒性明顯減少，但是免疫抑制能較強(qiáng)大[2,3]。但是西羅莫司在水中幾乎不溶，易溶于有機(jī)溶劑中，屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的Ⅱ類藥物。目前市場上只有口服的單一劑型，而且在胃液中容易遭受胃酸破壞，導(dǎo)致口服生物利用度僅為14%[4],極大的阻礙了在臨床上的廣泛的使用。自乳化給藥系統(tǒng)能夠提高難溶性藥物的生物利用度，緩釋給藥系統(tǒng)能使藥物緩慢釋放，提高藥物的作用時(shí)間和減少藥物的濃度的波動。

本實(shí)驗(yàn)采用擠出滾圓法制備西羅莫司自乳化緩釋微丸，考察制備工藝對目標(biāo)的收率的影響，并與淋巴細(xì)胞的作用進(jìn)行研究，為西羅莫司的新劑型研究提供新的方法[5,6]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

Capmul MCM（Abitec，USA）；二乙二醇單乙基醚（Transcutol? P）（Gattefossé，F(xiàn)rance）；聚氧乙烯醚-35氫化蓖麻油（CremophorEL-35）（BASF，Germany）；辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）（Gattefossé，F(xiàn)rance）；微晶纖維素（MCC）(批號：160523，陜西省西安北方惠安化學(xué)工業(yè)有限公司)；乳糖（江蘇省常州朗生生物工程有限公司）西羅莫司原料藥（批號060705，福建科瑞藥業(yè)有限公司）；羥丙甲基纖維素鈉（HPMC）（K4M，中國卡樂康公司）；甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯（吐溫-20）（化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；噻唑藍(lán)（上海碧云天生物科技有限公司）；二甲基亞砜（優(yōu)等級：河南薩默生物科技有限公司）；胎牛血清（含量10%，上海酶聯(lián)生物有限公司）；培養(yǎng)基（RPMI-160，賽默飛世爾中國有限公司）全制動酶聯(lián)免疫分析儀（Uranus AE，深圳愛康公司）；西羅莫司片（批號:20161215,WyethPharmaceuticals Company）其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

多功能滾圓機(jī)（CGC-350，重慶市英格造粒包衣技術(shù)有限公司）；軸向單螺桿擠出機(jī)（E-50，重慶市英格造粒包衣技術(shù)有限公司）；臺式微量高速離心機(jī)（H1650-W，湖南省長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電子分析天平(FA1104，上海精科天平有限公司)；激光粒度分析儀（Zetasizer Nano ZS，英國馬爾文公司）；二氧化碳恒溫箱（BPN-150CW，深圳市賽亞泰科有限公司）；高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent 1200）（四元泵、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器、Agilent化學(xué)工作站，美國Agilent公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（，河南省鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；水浴恒溫振蕩器（SHA-B 型，江蘇榮華儀器制造有限公司）；酶聯(lián)免疫分析儀（ELx800，美國BIO-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 自化微丸的制備

精密稱取微晶纖維素鈉19 g、羥丙甲基纖維素鈉20 g、乳糖31 g，按質(zhì)量從小到大等量滴加，使混合、充分均勻。再加入30 g西羅莫司液體自乳化給藥系統(tǒng)（Capmul MCM（油相）∶聚氧乙烯醚-35蓖麻油（表面活性劑）∶辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（表面活性劑）∶二乙醇單乙基醚（助表面活性劑）= 30∶28∶28∶14），快速攪拌，使充分混合均勻，即得到外觀略有潮濕的混合物，加入12 mL的純化水制備軟材，將軟材加入到微丸機(jī)中，在一定的擠出速度中擠出，擠出完畢后，迅速加入到一定轉(zhuǎn)速的滾圓機(jī)中滾圓、收集所有制備的微丸于40 ℃的恒溫烘干機(jī)中恒溫干燥24 h，過18～24目的篩，即可。

2.2 自乳化緩釋微丸的粒徑分析和目標(biāo)收率

采用篩分法測定緩釋微丸的粒徑分布范圍，分別收集大于16目、16～24目、24～40目和小于40目的緩釋微丸，稱重，計(jì)算不同粒徑范圍的收率，其中16～24目為我們的目標(biāo)收率。

2.3 雷帕霉素自乳化微丸的重分散性

分別取適量的西羅莫司液體自乳化給藥系統(tǒng)和適量的西羅莫司自乳化緩釋微丸加入到20 mL的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）中，在磁力攪拌器（37±1）℃中快速攪拌24 h, 使緩釋微丸充分裂解，待穩(wěn)定后，在離心機(jī)以5 000 r·min-1離心5 min后，取上層液體，用納米激光粒度儀測定形成乳液的粒徑和多分散系數(shù)。

2.4 微丸制備工藝的考察

在微丸的制備過程中，微丸的制備工藝對微丸的目標(biāo)收率[7]影響較大，所以選擇擠出速度、滾圓速度、滾圓時(shí)間作為考察對象，考察各自對目標(biāo)收率的影響。

2.4.1 擠出速度

在微丸制備工程中，軟材的擠出是制備的第一步，也是關(guān)鍵的步驟，本次研究擠出速度分別在25、45、65 r·min－1時(shí)對目標(biāo)粒徑的收率影響。

2.4.2 滾圓速度

滾圓速度是通過提供剪切力來影響微丸圓整度的關(guān)鍵因素，考察滾圓速率為 500、650、800 r·min－1時(shí)目標(biāo)粒徑微丸的收率。

2.4.3 滾圓時(shí)間

滾圓時(shí)間對微丸的成型性有較大影響，考察時(shí)間分別為 1、3、5 min時(shí)目標(biāo)粒徑微丸的收率。

2.5 人淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)

采集健康成人外周血，采用密度梯度離心法分離獲得外周血的單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞置于CO2濃度為5%、溫度為 （37±1）℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 6 h 后，分離，取上層即為所需細(xì)胞。用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）繼續(xù)培養(yǎng)待用[8]。

2.6 實(shí)驗(yàn)對照

將上層懸浮細(xì)胞按1×109/ L的濃度接種于 96 孔培養(yǎng)板中，取西羅莫司原料藥制備成20μg/L，西羅莫司片和西羅莫司緩釋微丸液配制成含有西羅莫司為20μg/L，實(shí)驗(yàn)分組可為3組，1個(gè)對照組( 西羅莫司原料藥) ，1個(gè)試驗(yàn)組(西羅莫司片)、和另外1個(gè)實(shí)驗(yàn)組（西羅莫司自乳化緩釋微丸)。取每組設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔，置入溫度為 （37±1）℃ 、濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 12，24，48，72，96 h 后，每孔加入 0. 5 g的L-1MTT 20 μL，繼續(xù)至于5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，棄去上清液，每孔中加入二甲亞砜（DMSO） 200 μL，在576 nm下，用酶聯(lián)免疫分析儀檢測的相應(yīng)數(shù)值。計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和兩組對照組中對應(yīng)的淋巴細(xì)胞增殖抑制率 ( % ) =( 1－實(shí)驗(yàn)組) /A對照組×100%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 自乳化微丸的重分散性研究

由表1可見，西羅莫司自乳化緩釋微丸遇水重分散后形成穩(wěn)定的乳劑，粒徑與液體自乳化比較有較小幅度的增大，但是仍在100 nm范圍內(nèi)，這表明自乳化微丸基本保持了液體自乳化給藥系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)；但多分散系數(shù)也稍有增大，原因可能是：自微乳給藥系統(tǒng)在溶劑中乳化的過程中受到輔料的影響，多分散系數(shù)增加，導(dǎo)致粒徑稍大。

表1 粒徑和多分散系數(shù)對比（，n = 3）

3.2 微丸制備工藝的考察

3.2.1 擠出速度

圖1 擠出速度對微丸收率的影響

由圖1可以看出，隨著擠出速率的增加，擠出的力度明顯增加，導(dǎo)致物料間的空隙較小，所以形成的粒徑也相對較小，導(dǎo)致在目標(biāo)粒徑范圍的比例增多，且各目標(biāo)收率間均具有顯著性差異，因而選擇65 r·min－1為擠出速度。

圖2 滾圓速度對微丸收率的影響

3.2.2 滾圓速度

由圖2可以看出，當(dāng)滾圓速度過大時(shí)，產(chǎn)生的細(xì)粉多，這是由于剪切力過大；當(dāng)滾圓速度過慢時(shí)，滾圓產(chǎn)生的啞鈴狀及棒狀微丸較多，這是由于剪切力不夠。由于各目標(biāo)收率間均具有顯著性差異，所以選擇650 r·min－1的滾圓速度。

3.2.3 滾圓時(shí)間

圖3 滾圓時(shí)間對微丸收率的影響

由圖3可以看出，滾圓時(shí)間過短，導(dǎo)致擠出物呈啞鈴狀居多，這是由于擠出條狀物受力不充分；滾圓時(shí)間過長導(dǎo)致微丸與微丸之間相互粘連，容易形成更大粒徑的微丸。由于各收率間均具有顯著性差異，這是由于長時(shí)間受到擠壓力，導(dǎo)致微丸間相互黏連。所以選定滾圓時(shí)間為3 min。

所以采用，在自乳化緩釋微丸的制備過程中，最佳的擠出速度為65 r·min－1，滾圓速度為650 r·min－1，滾圓時(shí)間為3 min。

3.3 自乳化緩釋微丸的粒徑分析和目標(biāo)收率

采用篩分法測定粒徑分布，結(jié)果顯示：未見直徑大于2.0 mm者，直徑為1.2～2.0 mm的微丸占總量（12.5±0.25）%；直徑為1.0～1.2 mm 的占總量（63.5±1.25）%，直徑為0.8～1.0 mm的占總量（16.8±0.69）%（=3），直徑＜0.8 mm的占總量（7.2±0.32）%，粒徑較均勻，符合微丸的規(guī)定。所以采用該制備工藝，西羅莫司自乳化緩釋微丸的目標(biāo)收率為（92.8±2.51）%（=3）。

3.4 西羅莫司自乳化緩釋微丸對淋巴細(xì)胞的作用

西羅莫司原料藥在12～48 h內(nèi)抑制作用迅速上升，達(dá)72.62%，至96 h抑制作用平緩達(dá)到83. 92%。西羅莫司自乳化緩釋微丸相對于西羅莫司原料藥和西羅莫司片而言，抑制的速度較慢，但是達(dá)到96 h時(shí)，抑制的效果更明顯，這說明制備成緩釋制劑，起到了緩慢釋放藥物的作用，能過顯著提高藥物的有效作用時(shí)間；這說明淋巴細(xì)胞增殖受到西羅莫司自乳化緩釋微丸、西羅莫司原料藥和西羅莫司片強(qiáng)大的抑制（表2）。

表2 各時(shí)間點(diǎn)西羅莫司自乳化微丸、西羅莫司片和西羅莫司原料藥對人淋巴細(xì)胞的抑制率

自乳化制劑能過顯著提高難溶性藥物的濃度。西羅莫司自乳化緩釋微丸的體外淋巴細(xì)胞增殖這與自乳化給藥系統(tǒng)提高難溶性藥物濃度有一定的作用。

4 結(jié)論

本文采用擠出滾圓法，以羥丙甲基纖維素鈉為骨架型緩釋輔料制備緩釋微丸，考察擠出速度、滾圓速度和滾圓時(shí)間對微丸目標(biāo)收率的影響；隨著擠出速率的增加，單位時(shí)間內(nèi)擠出的物料增多，且物料間較緊實(shí)，目標(biāo)粒徑微丸的收率增加，所以選擇擠出速度為65 r·min－1；由于剪切力的作用；當(dāng)滾圓速度過慢時(shí)，滾圓產(chǎn)生的啞鈴狀及棒狀微丸較多，滾圓速度過大時(shí)，產(chǎn)生的細(xì)粉多所以選擇滾圓速度為650 r·min－1的；滾圓時(shí)間需要受力充分，所以選擇時(shí)間為3 min。

通過本實(shí)驗(yàn)研究表明：西羅莫司緩釋微丸能夠抑制淋巴細(xì)胞的增值的活性，隨著時(shí)間增長，抑制作用增強(qiáng)，與西羅莫司原料藥和西羅莫司片相比較，能夠延長藥物的作用時(shí)間。所以西羅莫司緩釋微丸的血藥濃度更加平穩(wěn)，避免因血藥濃度波谷和波峰變化產(chǎn)生的不良反應(yīng)，提高了藥物的安全性，為西羅莫司的制劑開發(fā)提供一種全新的思路。

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Preparation of Sirolimus Self-emulsifying Sustained Release Pellets and Its Effect on Lymphocytes

，BAO Ming-wei

（People's Hospital of Wuhan University, Hubei Wuhan430060, China）

Taking hydroxypropyl methyl cellulose sodium as main sustained-release material, sirolimus self-emulsifying sustained release pellets were prepared by extrusion spheronization. Effect of preparation process conditions including extrusion speed, spheronization speed, spheronization time on the target yield was investigated, and effect of the pellets on lymphocytes was studied. The results showed that, the yield of self-emulsifying sirolimus sustained-release pellets was（92.8+2.51）% (=3)；suitable preparation process conditions were as follows：the extrusion speed 65 r·min－1,the spheronization speed 650 r·min－1,the spheronization time 3 min. Sirolimus sustained release pellets can inhibit the activity of increased lymphocyte activity and increase the inhibitory effect over time. This method provides a new way for the study of sirolimus sustained-release pellets.

Sirolimus;self-emulsifying drug delivery system; Pellets; Preparation technique; Lymphocyte

R 945

A

1671-0460（2017）12-2493-04

2017-09-15

聞超（1986-），男，湖北孝感人，藥師，研究生，研究方向：從事生物工程研究。E-mail：363428320@qq.com。

包明威（1974-），男，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事心臟電生理研究。