魏鳳，張文通，王艷，苗立中，沈志強(qiáng)，

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.山東省畜禽用蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東濱州256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

鴨坦布蘇病毒病實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述

魏鳳1,2，張文通3，王艷1，苗立中1，沈志強(qiáng)1，3

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.山東省畜禽用蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東濱州256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

鴨坦布蘇病毒病是引起蛋鴨產(chǎn)蛋下降、雛鴨神經(jīng)癥狀為主要特征的鴨重要傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展。正確診斷鴨坦布蘇病毒病對(duì)防制該病極為關(guān)鍵。本文就該病病原分離鑒定、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷三方面展開闡述，以期弄清該病診斷方面的研究進(jìn)展。

鴨坦布蘇病毒??；診斷方法；綜述

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋驟降、雛鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為主要特征的傳染病，該病幾乎侵染所有品種的鴨，蛋雞和鵝也有報(bào)道。臨床癥狀主要表現(xiàn)為蛋鴨產(chǎn)蛋率的驟降甚至停產(chǎn)、癱瘓等；未開產(chǎn)蛋鴨卵泡出血、萎縮；公鴨睪丸出血、萎縮，精子質(zhì)量下降、受精率低；肉鴨神經(jīng)癥狀、腦輕度出血。自2010年4月起，在我國(guó)江蘇、福建、浙江等省份陸續(xù)發(fā)生，并迅速蔓延至我國(guó)各個(gè)主要養(yǎng)鴨省市，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

防制該病的關(guān)鍵措施之一是對(duì)該病病原的確診。依靠對(duì)發(fā)病鴨群的病史、臨床癥狀、剖檢病變這些傳統(tǒng)診斷方法可以進(jìn)行初步診斷，但弄清病原必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。自2010年分離出該病原以來，科研工作者對(duì)該病確診進(jìn)行了大量的研究，取得了顯著成績(jī)。本文就該病實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展進(jìn)行了如下綜述。

1 病毒分離鑒定

無菌采集病鴨或病死鴨的肝臟、脾臟、腎臟、腦等病變組織樣品；研磨離心后，病毒上清液用0.22μm過濾除菌；經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡SPF雞胚，接種后48～120h雞胚死亡；死亡高峰期集中在第4天，主要表現(xiàn)為絨毛尿囊膜明顯增厚，胚體水腫、出血。收獲死亡雞胚尿囊液接種鴨胚成纖維細(xì)胞或DF-1細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生細(xì)胞病變，能夠成功分離到DTMUV。病原的分離鑒定是檢測(cè)鴨坦布蘇病最準(zhǔn)確和經(jīng)典的方法，但此法受多種因素限制（比如費(fèi)時(shí)費(fèi)力、工作量大，需要預(yù)處理樣品，對(duì)人員要求高等），不適用于快速檢測(cè)。

2 血清學(xué)診斷

常用的血清學(xué)檢測(cè)方法主要有中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和間接免疫熒光法。這些方法在臨床樣品的快速、早期診斷方面運(yùn)用非常廣泛。

中和抗體是機(jī)體受到外源病毒感染后產(chǎn)生的能特異性結(jié)合病毒，阻斷病毒與易感細(xì)胞上的受體相結(jié)合，從而抑制病毒的入侵，使病毒失去感染能力。測(cè)定中和抗體的檢測(cè)方法可分為兩種：固定血清稀釋病毒法和固定病毒稀釋血清法。這兩種方法雖然結(jié)果可靠準(zhǔn)確，但是耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，操作過程復(fù)雜，而且特異性和敏感性都偏低，因此無法達(dá)到快速批量檢測(cè)的要求。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以其快速、高通量、靈敏等特點(diǎn)，已廣泛用于各種抗原和抗體的臨床檢測(cè)。ELISA分為直接ELISA、間接ELISA、雙抗夾心ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA，可根據(jù)不同的檢測(cè)目的和要求靈活使用[2]。目前ELISA已成為鴨坦布蘇病快速診斷的常規(guī)方法，較為常用的是間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA。姬希文等以純化的鴨坦布蘇病毒分離株作為包被抗原，建立了檢測(cè)DTMUV血清抗體的間接ELISA法，該方法特異性好、敏感性高、穩(wěn)定性強(qiáng)；應(yīng)用該方法檢測(cè)臨床鴨血清，檢出率遠(yuǎn)高于瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)方法[3]。郝明飛等以純化的鴨坦布蘇病毒重組E蛋白作為包被抗原，初步建立了檢測(cè)E蛋白抗體的間接ELISA方法，證實(shí)有較好的特異性和敏感性[4]。傅秋玲等以鴨坦布蘇病毒E蛋白的主要優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)E1蛋白作為包被抗原，建立檢測(cè)鴨坦布蘇病毒中和抗體效價(jià)的間接ELISA方法；利用該方法對(duì)237份來自福建省開產(chǎn)麻鴨的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，其血清陽性率達(dá)77.9%[5]。王善輝等以鴨坦布蘇病毒重組桿狀病毒表達(dá)的E蛋白作為包被抗原,建立間接ELISA檢測(cè)方法；利用該方法對(duì)135份來自江蘇省的櫻桃谷鴨血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其血清陽性率達(dá)79.3%[6]。孫敏華等以鴨坦布蘇病毒NS1蛋白為包被原建立了檢測(cè)鴨血清中鴨坦布蘇病毒抗體的間接ELISA方法；用建立的ELISA方法檢測(cè)臨床鴨坦布蘇病毒感染鴨及攻毒蛋鴨的55份臨床血清樣品，測(cè)得52份為陽性,陽性率為94.5%，對(duì)36份陰性鴨群血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，36份為陰性，陰性率為100%[7]。董嘉文等以純化好的截短的DTMUVE蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)DTMUV血清抗體的間接ELISA方法；用建立的ELISA方法對(duì)免疫鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的鴨血清和對(duì)照鴨血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，同時(shí)與攻毒保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行比較，兩者的陽性符合率為86.67%，陰性符合率為100%[8]。

間接免疫熒光法（IFA）：免疫熒光技術(shù)是將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。在熒光顯微鏡下我們可檢測(cè)出熒光素所發(fā)出的熒光，從而可從細(xì)胞上定位出抗原。目前為止，DTMUV抗體的檢測(cè)可通過該方法來實(shí)現(xiàn)。但該方法操作復(fù)雜，對(duì)操作人員要求高，不適合臨床快速檢測(cè)[9]。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)

憑借先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)知識(shí)，DTMUV全基因組序列已經(jīng)測(cè)定完成并將完整的基因序列在NCBIGenBank中公布，科研工作者以此為基礎(chǔ)，研制了多種針對(duì)DTMUV的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。主要包括RT-PCR、套式RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

張帥等在對(duì)DTMUV序列的比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立了DTMUV的一步法RT-PCR檢測(cè)方法；該方法對(duì)2010年至2011年6月份前的106份產(chǎn)蛋下降鴨群臨床病料進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示樣品陽性率為46.2%[10]。王建昌等根據(jù)GenBank中登錄的DTMUVE基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，建立了檢測(cè)DTMUV的一步法RT-PCR對(duì)20份模擬臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，一步法RT-PCR的陽性率為75%[11]。

顏丕熙等根據(jù)鴨坦布蘇病毒E基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)重疊引物P1、P2和P3、P4，建立了檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的套式RT-PCR方法，該套式RTPCR比一般PCR敏感性高10倍[12]。

李慶陽等根據(jù)鴨坦布蘇病毒BYD-1株基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針,建立了快速檢測(cè)DTMUV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法；利用該方法分別對(duì)攻毒感染具有典型鴨新型黃病毒病臨床癥狀和病理變化的蛋鴨的脾臟和肝臟組織進(jìn)行檢測(cè),陽性率均為100%[13]。萬春和等根據(jù)鴨坦布蘇病毒NS5基因序列特征設(shè)計(jì)引物，建立基于SYBRGreenⅠ檢測(cè)模式的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，該方法特異性好[14]。靳宇田等設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物及TaqMan探針，建立了檢測(cè)DTMUV的熒光定量RT-PCR方法；對(duì)來源于江蘇省和安徽省的29份疑似鴨坦布蘇病毒感染的病鴨組織進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè),結(jié)果有27份呈現(xiàn)陽性，陽性檢出率為93.10%，比常規(guī)RT-PCR的敏感性高[15]。

[1]李澤君.鴨坦布蘇病毒病病原的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)家禽,2011,(17):34-35.

[2]余斌,華炯鋼,劉躍生,等.鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用[J].浙江畜牧獸醫(yī), 2014,(05):1-6.

[3]姬希文,閆麗萍,顏丕熙,等.鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011,(08):630-634.

[4]郝明飛,張琳,胡北俠,等.鴨坦布蘇病毒包膜蛋白的原核表達(dá)和間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,(12):17-22.

[5]傅秋玲,陳珍,施少華,等.鴨坦布蘇病毒E蛋白包被抗原間接ELISA方法的建立[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015, (01):1-5.

[6]王善輝,謝金文,強(qiáng)成魁,等.鴨坦布蘇病毒E基因重組桿狀病毒的構(gòu)建與間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)家禽,2016,(01):21-24.

[7]孫敏華,郭建偉,李林林,等.檢測(cè)鴨坦布蘇病毒NS1抗體ELISA方法的建立[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技, 2017,(01):37-40.

[8]董嘉文,李林林,孫敏華,等.鴨坦布蘇病毒JM株E蛋白的截?cái)啾磉_(dá)及間接ELISA方法的建立[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2017,(01):12-18.

[9]李國(guó)平.鴨坦布蘇病毒RT-PCR診斷方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,(01):69-72.

[10]張帥，云濤，葉偉成，等.鴨坦布蘇病毒一步法RTPCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012,(01):37-40.

[11]王建昌,王金鳳,袁萬哲,等.鴨坦布蘇病毒一步法RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016,(08):629-633.

[12]顏丕熙,李國(guó)新,吳曉剛,等.應(yīng)用套式RT-PCR快速檢測(cè)鴨坦布蘇病毒[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2011,(03):34-37.

[13]李慶陽,陳芳艷,劉平,等.鴨坦布蘇病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,(07):18-22.

[14]萬春和,朱海俠,施少華,等.鴨坦布蘇病毒SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,(07):973-978.

[15]靳宇田,黃顯明,許秀梅,等.鴨坦布蘇病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2013,(04):46-50.

Review of the Diagnostic Method of Duck Tembusu Virus Disease

WEI Feng1,2,ZHANG Wen-tong3,WANG YAN1,MIAO Lizhong1,SHEN Zhi-qiang1,3,
(1.Shandong Binzhou Animal Science＆Veterinary Medicine Academe,Binzhou 256600; 2.Shandong Province Animal Propolis Vaccine Research&Development Center,Binzhou 256600; 3.Shandong LvDu Biological Technology Co,Ltd.Binzhou 256600)

Duck tembusu virus disease causes laying ducks egg drop,goose of cheeper duck neurological symptoms as the main characteristics of the duck important infectious disease, serious harm to healthy development of the duck industry.Correct diagnosis haemophilus parasuis is the key measures to control the disease.This paper described isolation and identification of pathogeny,serological diagnostics,molecular biology disease diagnosis,to understand advances in diagnosis of the disease.

duck tembusu virus disease;diagnostic method;review.□

S858.324.4+3

A

1673-1085（2017）07-0036-03

2017-06-12