張一爽,曲曉軍,崔艷華

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,哈爾濱 150090;2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所,哈爾濱 150010)

發(fā)酵乳中乳酸菌產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)

張一爽1,曲曉軍2,崔艷華1

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,哈爾濱 150090;2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所,哈爾濱 150010)

從發(fā)酵乳主要風(fēng)味物質(zhì)的種類、形成過程、基因調(diào)控以及乳酸菌蛋白水解體系在發(fā)酵乳風(fēng)味產(chǎn)生中的重要作用進(jìn)行了闡述.

發(fā)酵乳;乳酸菌;風(fēng)味;蛋白水解體系

0 引言

發(fā)酵乳是一種富有營養(yǎng)、對人體健康有益的奶制品.從化學(xué)角度看,其是一種具有特殊質(zhì)地、口感、香氣和風(fēng)味且含有蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)的復(fù)雜的凝膠體系[1].發(fā)酵乳可以改善胃腸道狀況,對乳糖不耐癥、便秘、腹瀉具有一定的緩解作用[2-5].發(fā)酵乳因其良好的感官風(fēng)味而受到廣大消費(fèi)者的歡迎.食品工業(yè)上,主要通過將鮮牛乳在一定的溫度和環(huán)境條件下加入德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌聯(lián)合發(fā)酵劑發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵乳[6].乳糖在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸,乳酸可以使蛋白質(zhì)變性,從而賦予發(fā)酵乳一定的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味特點(diǎn).本文從發(fā)酵乳主要風(fēng)味物質(zhì)的種類以及形成過程,基因調(diào)控以及乳酸菌蛋白水解體系在發(fā)酵乳風(fēng)味產(chǎn)生中的重要作用進(jìn)行闡述.

1 發(fā)酵乳中乙醛和雙乙酰及其形成過程

發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)主要是德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸以及各種有機(jī)芳香化合物,其中包括牛奶中本身具有的芳香化合物和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的芳香化合物[7-10].乳中乳糖、乳蛋白和乳脂肪通過微生物的發(fā)酵或酶促反應(yīng)產(chǎn)生有機(jī)酸、酮、醛、酯、芳香族化合物、含硫化合物等風(fēng)味物質(zhì)[11].乙醛和雙乙酰在發(fā)酵乳風(fēng)味中起到關(guān)鍵作用,將著重介紹以上兩種風(fēng)味化合物.

1.1 乙醛

羰基化合物是發(fā)酵乳的主要風(fēng)味成分之一,其中乙醛是所有羰基化合物中對發(fā)酵乳風(fēng)味的產(chǎn)生的最關(guān)鍵因素[12].高濃度的乙醛有刺鼻的令人不愉快的氣味,但是低濃度的乙醛則會產(chǎn)生一種令人愉快的水果香氣.乙醛是發(fā)酵乳發(fā)酵過程中含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他揮發(fā)性芳香化合物,是發(fā)酵乳中重要的特征風(fēng)味化合物[13-14].

乙醛在發(fā)酵乳發(fā)酵過程中的產(chǎn)生方式可大致歸為以下幾種:(1)葡萄糖在糖酵解途徑中分解成2分子丙酮酸,丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的作用下脫羧,直接產(chǎn)生乙醛并釋放CO2,此途徑是乙醛形成的關(guān)鍵途徑;(2)丙酮酸在丙酮酸脫氫酶和甲酸裂解酶的作用下形成乙酰輔酶A,生成的乙酰輔酶A在乙醛脫氫酶的連續(xù)催化下生成乙醛;(3)脫氧核糖醛縮酶將脫氧胸腺嘧啶轉(zhuǎn)化為乙醛和3-磷酸甘油醛.此外,Charve等人報(bào)道乳酸菌產(chǎn)生乙醛的另一種途徑,即蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶的作用下直接生成乙醛[15].

1.2 雙乙酰

雙乙酰(又稱2,3-丁二酮)也同樣是發(fā)酵乳風(fēng)味的重要物質(zhì)之一.雙乙酰是雙酮類化合物,由乳酸菌發(fā)酵代謝乳或者乳制品中的檸檬酸產(chǎn)生[16].雙乙酰一般由嗜溫乳酸球菌生產(chǎn),包括乳酸乳球菌丁二酮亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種和嗜熱鏈球菌等[17].一些乳酸菌,特別是乳球菌能利用乳糖、檸檬酸生成丙酮酸,再合成雙乙酰[11].

Kaneko等人發(fā)現(xiàn)豆乳中由嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的過量的雙乙酰引發(fā)了發(fā)酵豆乳的不愉快氣味.通過加入左旋纈氨酸可以在嗜熱鏈球菌發(fā)酵過程中降低雙乙酰的含量提高乙醛的含量.此外通過加入纈氨酸,可使乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(acetohydroxy acid isomero?reductase)基因ilvC被抑制,乙酰乳酸合成酶(acetolac?tate synthase)基因als和α-乙酰乳酸脫羧酶(acetolac?tate decarboxylase)基因aldB被激活.感官評定的結(jié)果也顯示纈氨酸的加入可使發(fā)酵豆乳的風(fēng)味得到很大改善[18].

2 風(fēng)味物質(zhì)的基因調(diào)控

隨著人們對乳酸菌代謝途徑途徑的明晰以及對風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制的深入認(rèn)識,通過基因改性和遺傳修飾來改變風(fēng)味物質(zhì)含量已經(jīng)是當(dāng)今研究的一大熱點(diǎn).風(fēng)味物質(zhì)的水平可以通過分子生物學(xué)的方法得到提高.

嗜熱鏈球菌的重要風(fēng)味代謝物的產(chǎn)生水平可以通過als基因和乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因adhB的過表達(dá)得到提升.通過als基因和adhB基因的過表達(dá)可以獲得高水平的2,3-丁二醇和乙醇[19].由glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(serine hy?droxymethyltransferase)具有蘇氨酸醛縮酶的活性,催化L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸和乙醛[20].研究者從8株具有良好風(fēng)味特性的嗜熱鏈球菌中,篩選出高產(chǎn)乙醛的MGD4-7菌株,用于確定在有無L-蘇氨酸存在的條件下,乙醛生產(chǎn)和glyA基因的表達(dá).研究結(jié)果表明,乙醛產(chǎn)量隨著發(fā)酵乳中的L-蘇氨酸含量增加而增加.實(shí)時(shí)定量PCR分析表明,發(fā)酵乳含有L-蘇氨酸時(shí),glyA基因表達(dá)量增加[20].代謝途徑的深入認(rèn)識,將有助于改善嗜熱鏈球菌的乙醛合成能力.

Liu等人發(fā)現(xiàn)將棕櫚發(fā)酵菌(Zymobacter palmae)中的丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase)pdc基因?qū)肴樗崛榍蚓罂色@得高產(chǎn)乙醛的乳酸菌[21].Monnet等人發(fā)現(xiàn)用尿素鹽酸胍處理乳酸乳球菌,篩選出的α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型并且乳酸脫氫能力低下的變異型菌株,可以在無氧牛乳培養(yǎng)基里產(chǎn)生高量的α-乙酰乳酸和雙乙酰[22].Aymes等用隨機(jī)誘變的方法篩選出α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型的乳酸乳球菌丁二酮亞種菌株,在厭氧條件下,雙乙酰的產(chǎn)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生菌株雙乙酰的產(chǎn)量[23].

劉文俊等通過q-PCR定量分析技術(shù)對嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種與發(fā)酵代謝和風(fēng)味形成相關(guān)的功能基因動態(tài)表達(dá)變化的研究表明:乙醛含量隨丙酮酸脫羧酶基因、乙醛-乙醇脫氫酶基因及丙酮酸脫氫基因表達(dá)量的升高而增加,而隨著L-乳酸脫氫酶基因的表達(dá)量的升高而減小,這個(gè)基因的表達(dá)可能不利于乙醛含量的積累[24].

3 發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)檢測方法

發(fā)酵乳中揮發(fā)性物質(zhì)的儀器分析主要是通過氣相色譜(GC)完成的,在少數(shù)情況下可通過高效液相色譜法檢測[25-26].很多探測器可以探測發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),如火焰離子化檢測器(FID)、熱導(dǎo)池檢測器(TCD)、電子捕獲器(ECD)、火焰光度檢測器(FPD)、光離子化檢測器(PID)、質(zhì)譜儀(MS)等[29].氣譜-質(zhì)譜的方法由于其能對已知物質(zhì)檢測定量,對未知物質(zhì)的識別及分析分子化學(xué)特性的能力而在風(fēng)味分析中廣泛應(yīng)用[28].

目前檢測酸奶中乙醛、雙乙酰含量國內(nèi)外均有研究,主要是采用固相微萃取-氣譜-質(zhì)譜(SPME-GC-MC)技術(shù)和動態(tài)頂空-氣譜-質(zhì)譜(DHS-GC-MS)技術(shù),由于其所需設(shè)備耗資不菲不適合大面積推廣[29-31].下面介紹實(shí)驗(yàn)室常見的檢測發(fā)酵乳中乙醛和雙乙酰含量的方法.

在酚試劑分光光度測定法中乙醛與酚試劑[C6H4SN(CH3)C:NNH2.HCl,3-甲基-2-苯并噻唑腙,NBTH]反應(yīng)生成嗪類物質(zhì),在酸性溶液中,嗪類物質(zhì)被高鐵離子氧化形成藍(lán)綠色化合物,應(yīng)用分光光度計(jì)比色定量[32].發(fā)酵乳中的雙乙酰類和鄰苯二胺反應(yīng)生成2,3-二甲基吡嗪,生成物的鹽酸鹽在335 nm波長下有一最大吸收峰,利用這一信息對實(shí)現(xiàn)對雙乙酰進(jìn)行定量測定[33-34].

通過傳統(tǒng)方法進(jìn)一步提取和分析風(fēng)味化合物較為耗時(shí).最近,研究者評估了43株嗜熱鏈球菌的發(fā)酵時(shí)間、酸度和風(fēng)味特性.同時(shí),以產(chǎn)乙醛和雙乙酰相關(guān)的8個(gè)功能基因的序列對菌株進(jìn)行多位點(diǎn)分型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以功能基因型分組的結(jié)果與以表現(xiàn)型特性為基礎(chǔ)的分組結(jié)果是一致的[24].另一個(gè)關(guān)于德氏乳桿菌保加利亞桿菌的研究也得出類似結(jié)果[35].以上研究表明,細(xì)菌功能基因的多位點(diǎn)分型分析可以用來預(yù)測生產(chǎn)酸奶菌株的發(fā)酵和風(fēng)味特性[24,35].

4 乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)與風(fēng)味物質(zhì)的形成

乳酸菌的蛋白酶水解系統(tǒng)對于乳酸菌在乳中的生長是必需的,同時(shí)對發(fā)酵乳制品的風(fēng)味具有重要的影響.乳酸菌需要必需氨基酸來滿足自身的生長需要,大部分乳酸菌需要蛋氨酸、組氨酸、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酸和纈氨酸等氨基酸[36].由于牛乳中游離的氨基酸和肽的含量非常低,所以乳酸菌需要依靠自身的蛋白水解系統(tǒng)來將乳中的酪蛋白降解成氨基酸或肽以利于其吸收.乳酸菌的蛋白水解能力不如枯草芽孢桿菌、假單胞菌、地衣芽胞桿菌等細(xì)菌強(qiáng),但適度的蛋白水解對乳制品風(fēng)味和質(zhì)地的改善是相當(dāng)重要的,特別是乳酸菌的蛋白水解及菌體破裂后釋放的酶在干酪成熟過程中起到非常重要作用[37].

乳酸菌在牛奶中生長產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)的前體是酪蛋白[38].酪蛋白通過乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)被降解成氨基酸.乳酸菌蛋白分解釋放的氨基酸中除其本身對酸奶的風(fēng)味產(chǎn)生一定影響,然后游離的氨基酸被轉(zhuǎn)化為不同的風(fēng)味物質(zhì),如醇、醛、酯等[28,38].如纈氨酸和蛋氨酸均可降解產(chǎn)生乙醛,纈氨酸可降解為乙醛和丙氨酸,蛋氨酸則是轉(zhuǎn)化為蘇氨酸后,被蘇氨酸醛縮酶分解為乙醛和甘氨酸,這些成分對發(fā)酵乳風(fēng)味的產(chǎn)生也具有重大的作用[39].這些風(fēng)味物質(zhì)主要來自于支鏈氨基酸,芳香族氨基酸和含硫氨基酸[38-41].氨基酸轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)是通過轉(zhuǎn)氨途徑實(shí)現(xiàn)的,其中α-keto作為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶的受體.

乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)主要包括三個(gè)部分:(1)胞外蛋白酶:可將大分子酪蛋白水解成多肽;(2)多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng):將多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi);(3)多種肽酶:將轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的多肽進(jìn)一步水解成自由氨基酸,這些氨基酸最終進(jìn)行代謝或合成蛋白質(zhì).

4.1 胞外酶

乳酸菌對酪蛋白的水解是首先通過胞外酶來實(shí)現(xiàn)的.胞外酶的作用是將酪蛋白分解成多肽.胞外酶大體分為5種類型:PrtP(主要存在于乳酸乳球菌)、PrtB(主要存在于德氏乳桿菌保加利亞亞種)、PrtS(主要存在于嗜熱鏈球菌)、PrtH(瑞士乳桿菌Lactoba?cillus helveticus)和PrtR(鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rham?nosus)[42].

與大多數(shù)乳酸菌僅有1個(gè)胞外蛋白酶不同,瑞士乳桿菌含有至少兩個(gè)胞外蛋白酶PrtH和PrtH2.Beg?anovi等人通過瓊脂擴(kuò)散法以及SDS-PAGE等方法研究了43株乳酸菌的酪蛋白水解特性,發(fā)現(xiàn)L.helveticus M92產(chǎn)酸能力最強(qiáng),且具有最突出的蛋白水解能力[43].同一菌種不同菌株的蛋白水解能力存在著明顯的差異.Sadat-Mekmene等人研究了15個(gè)來源不同的瑞士乳桿菌菌株的蛋白酶活性,發(fā)現(xiàn)菌株間的蛋白酶活性存在著明顯的差異[44].

胞外酶通常錨定在細(xì)胞壁上,但是Chang等人最近發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌4F44菌株可以產(chǎn)生可溶性的游離的PrtS,通過在新設(shè)計(jì)的YLUNi培養(yǎng)基(含8 g/L酵母提取物、20 g/L乳糖、5 g/L尿素和2 mg/L氯化鎳)上培養(yǎng)嗜熱鏈球菌4F44菌株,可以獲得高產(chǎn)量的可溶性的PrtS,可以作為蛋白水解劑,產(chǎn)生活性肽[45].

4.2 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的作用是將由胞外酶將酪蛋白水解成的多肽移至胞內(nèi).乳酸菌的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有三種:DtpP(用于轉(zhuǎn)運(yùn)二肽)、DtpT(用于轉(zhuǎn)運(yùn)三肽)和Opp(用于轉(zhuǎn)運(yùn)寡肽)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng).Opp轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對于乳酸菌的蛋白水解體系是必不可少的,而DtpP和DtpT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對乳酸菌而言是不必需的[46].Picon等人測定24株乳酸乳球菌的蛋白水解體系中相關(guān)酶的酶活,發(fā)現(xiàn)其中18個(gè)菌株中含有Opp和Dpp兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),而且具有較高的活力.此外這些菌株中的肽酶活力也較高[47].近來,Jameh等人通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌LMD-9菌株中,含有一個(gè)潛在的新型肽/鎳ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng).研究者將其命名為嗜熱鏈球菌寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Oligopeptide Transporter of S.ther?mophilus,OTS),該系統(tǒng)由肽/鎳結(jié)合蛋白OtsA、透性酶(OtsB和OtsC)和1個(gè)ATP酶OtsD組成.將LMD-9和LMD-9突變體(部分敲除otsA和otsB)在不同氮源和尿素和鎳中的生長進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)與鎳的運(yùn)輸無關(guān),而是充當(dāng)了新型的二肽或三肽轉(zhuǎn)運(yùn)子[48].

4.3 肽酶

肽酶的作用是將轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的二肽、三肽和多肽分解成游離的氨基酸,以滿足菌體生長需要.在奶酪模型系統(tǒng)中基因失活和基因過表達(dá)的研究顯示有幾種肽酶在決定后熟過程氨基酸總量上起著重要的作用,這幾種肽酶包括PepT、PepW、PepN、PepX和PepQ[49-50].Liu等人通過對比脯氨酸肽酶PepI、PepP、PepL和酯酶A的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)了保守的核心結(jié)構(gòu),可利用其改善在蛋白亞科內(nèi)的系統(tǒng)分析和功能注釋[51].

5 結(jié)束語

對乳酸菌發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的研究一直是當(dāng)今乳酸菌研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn).乙醛和雙乙酰是乳酸菌發(fā)酵過程中最為重要的兩大風(fēng)味物質(zhì).隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,通過遺傳修飾可以大大改善和提高乳酸菌的風(fēng)味性能.酪蛋白的水解對于發(fā)酵乳的風(fēng)味和質(zhì)地至關(guān)重要.通過研究乳酸菌蛋白酶的特性可篩選優(yōu)良發(fā)酵乳用菌種,進(jìn)而為高質(zhì)量的發(fā)酵乳的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ).

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Flavor produced by Lactic acid bacteria in fermented milk

ZHANG Yishuang1,QU Xiaojun2,CUI Yanhua1
(1.Department of Food Science and Engineering,School of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China;2.Institute of Microbiology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150010,China)

In this paper,we reviewed the types and flavor-forming routes of flavor compounds,functional genes as well as proteolytic system and its role in the production of flavor in fermented milk.

fermented milk;Lactic acid bacteria;flavor;proteolytic system

TS252.54

B

1001-2230(2017)10-0028-05

2017-02-13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471712;31371827).

張一爽(1995-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)榉肿游⑸飳W(xué).

崔艷華