莊宇 遼寧省遼陽市疾病預防控制中心理化檢驗科 （遼寧 遼陽 111000）

LC-AFS聯用測定形態(tài)硒流動相的選擇

莊宇 遼寧省遼陽市疾病預防控制中心理化檢驗科 （遼寧 遼陽 111000）

研究液相色譜與原子熒光聯用測定硒化合物形態(tài)時流動相對三個形態(tài)硒的分離情況和靈敏度的影響。實驗確定了最佳的流動相為5 mmol/L檸檬酸（pH=4.5）。在優(yōu)化的測定條件下，硒代胱氨酸（SeCys），四價硒（SeⅣ），硒代蛋氨酸（SeMet）三種形態(tài)的硒化合物能夠在10min內被很好的分離，其保留時間分別為硒代胱氨酸3.106min，亞硒酸根4.603min，硒代蛋氨酸7.713min。以5 mmol/L檸檬酸（pH=4.5）作為流動相對茶葉樣品中的硒化合物形態(tài)進行了分析。

LC-AFS 硒 形態(tài)分析 流動相

作為人體必需的微量營養(yǎng)元素之一，硒能夠參加人體的多種代謝過程，在機體抗癌、抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用。而不同形態(tài)的硒化合物對人體的作用不一致，其在動物體內的生物利用度、有效性、毒性以及代謝規(guī)律等不僅與硒的總量有關，而且與硒存在的化學形態(tài)密切相關?？茖W家們建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法，原子吸收光譜法等方法來研究硒的形態(tài)[1,2]。近年來，隨著原子熒光聯用技術的發(fā)展，科學家們逐漸開始利用液相色譜與原子熒光聯用技術來測定硒化合物形態(tài)，并對其測定條件進行了優(yōu)化[2,3]。但這些報道中所用的流動相均為NH4H2PO4溶液，本文嘗試以5mmol/L，pH=4.5的檸檬酸作為流動相來實現對形態(tài)硒的分離，取得了令人滿意的結果。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

設備儀器：SK-樂析-LC液相色譜原子熒光聯用儀（北京金索坤技術開發(fā)有限公司），配汞高性能空心陰極燈。DT-501A電子天平（常熟市金羊砝碼有限公司）；色譜柱（安捷倫科技有限公司）；PHS-2F型臺式pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

條件：負高壓設置為240V，燈電流80mA，載氣和輔氣流速分別為600mL/min和800mL/min，原子熒光泵轉速100r/min，形態(tài)泵轉速50r/min，進樣體積為100μL。

試劑：鹽酸（優(yōu)級純），過硫酸鉀（優(yōu)級純），氫氧化鉀（優(yōu)級純），硼氫化鉀（分析純），檸檬酸（分析純），氨水（分析純），硒標準溶液（國家環(huán)境保護總局標準樣品研究所）。

本實驗所用水均為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

10%鹽酸（體積比）：量取50mL鹽酸，緩慢加入450mL水中。

0.5 %氫氧化鉀-1.5%硼氫化鉀：分別稱取2.5g氫氧化鉀，7.5g硼氫化鉀，溶于500mL水中。

2%鹽酸-3%過硫酸鉀：量取10mL鹽酸，緩慢加入490mL水中，再稱取15.0g過硫酸鉀溶于該溶液中。

5mmol/L的檸檬酸：稱取0.525g檸檬酸，溶于500mL水中，用氨水調節(jié)pH值分別為3.5，4.0，4.5，5.0，過0.22μm的水系濾膜。

10mmol/L的檸檬酸：稱取1.05g檸檬酸，溶于500mL水中，用氨水調節(jié)pH值為4.5，過0.22μm的水系濾膜。

20mmol/L的檸檬酸：稱取2.10g檸檬酸，溶于500mL水中，用氨水調節(jié)pH值為4.5，過0.22μm的水系濾膜。

標準儲備液的配置：

分別稱取10mg硒代胱氨酸，硒帶蛋氨酸，四價硒于3個50mL容量瓶，先加入40mL水，再加入2滴1:1鹽酸，最后再用水定容至刻度，分別配制成濃度為200μg/mL的三種硒化合物溶液，以硒計濃度為別為43.3μg/mL，39.4μg/mL和42.9μg/mL。

分別移取24μL的亞硒酸根標準溶液，250μL的硒帶蛋氨酸標準溶液和21μL的硒代胱氨酸于10mL容量瓶中，用水定容。此時，亞硒酸根和硒代胱氨酸的濃度為100ng/mL，硒代蛋氨酸的濃度為1μg/mL。將其逐級稀釋，分別得到亞硒酸根，硒代胱氨酸濃度為0，10，20，40，80，100ng/mL，硒代蛋氨酸的濃度為0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0μg/mL的標準系列溶液。

進樣量100μL。

1.2.2 樣品前處理

按照文獻[4]報道的方法，對市售茶葉樣品進行前處理。準確稱取0.5g樣品于15mL離心管中，加入10mL體積比1:1的鹽酸作為提取液，混合均勻，超聲波超聲20min，再在12000r/min條件下離心10min，用0.22μm濾膜的針頭濾器過濾上清液，同時制備空白液[5]。稀釋濾液，檢測Se形態(tài)。

2.結果與討論

2.1 流動相pH值對保留時間和靈敏度的影響

保持流動相中檸檬酸的濃度為20mmol/L，改變溶液的pH，當流動相的pH值改變時，對亞硒酸根和硒代蛋氨酸的保留時間和靈敏度有影響。隨著pH增大，亞硒酸根與硒代蛋氨酸的保留時間逐漸減小；亞硒酸根的靈敏度逐漸增加，而硒代蛋氨酸的靈敏度有所下降。當pH由4.5增加至5.0時，亞硒酸根的靈敏度不再增加。但是pH對亞硒酸根保留時間和靈敏度的影響更明顯。

2.2 檸檬酸濃度對保留時間和靈敏度的影響

流動相中檸檬酸的濃度對三種硒形態(tài)化合物的分離效果的影響結果，不同濃度的檸檬酸只對Se（IV）的保留時間和靈敏度有顯著影響，而對另外兩種形態(tài)硒的保留時間影響不大。隨著檸檬酸濃度的增加，Se（IV）的保留時間逐漸減小，靈敏度逐漸增加。而硒代蛋氨酸的保留時間略有減小，靈敏度逐漸增加。

2.3 方法學測試

優(yōu)化后的濃度為100ng/mL（硒代蛋氨酸濃度為1000ng/mL）的三種形態(tài)硒化合物的液相，三種形態(tài)硒可以在10min以內完全分離。其保留時間分別為：硒代胱氨酸3.106min，亞硒酸根4.603min，硒代蛋氨酸7.713min。

用實驗中優(yōu)化的流動相對三種形態(tài)硒化合物的混合標準溶液系列進行線性回歸實驗，并平行測定7次濃度為100ng/mL（硒代蛋氨酸濃度為1.0μg/mL）的混合標準溶液。

2.4 樣品分析

用實驗中優(yōu)化的測試條件對茶葉樣品中三種硒的含量進行分析，并進行加標回收實驗。樣品平行測定3次，結果加標回收率在90.7%～93.5%。

3.結論

本文選擇了以檸檬酸為流動相檢測形態(tài)硒，探究了流動相中檸檬酸濃度以及pH值對三種形態(tài)硒的分離度及靈敏度的影響，選定了最佳的流動相為5mmol/L檸檬酸（pH=4.5）。將三種形態(tài)硒的檢測時間控制在10min之內，保留時間分別為：硒代胱氨酸3.106min，亞硒酸根4.603min，硒代蛋氨酸7.713min。該方法對檢測食品中硒形態(tài)化合物具有實際應用價值。

[1] 中華人民共和國國家標準.GB 5009.93-2010,食品安全國家標準食品中硒的測定[S].2010.

[2] 中華人民共和國地方標準.DB 3301/T 117-2007.稻米中有機硒和無機硒含量的測定原子熒光光譜法[S].2007.

[3] 王欣,幸苑娜,陳澤勇,等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法檢測富硒食品中6種硒形態(tài)[J].分析化學,2013,41(11):1669-1674.

[4] 王丙濤,謝麗琪,林燕奎,等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測食品中的五種硒形態(tài)[J].色譜,2011,29(3):223-227.

[5] 姚晶晶,袁友明,王明銳,等.高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光法測定茶葉中的3種硒形態(tài)[J].現代農業(yè)科技,2015,42(21):297-298.

Selection of LC - AFS for the Determination of Selenium Mobile Phase

ZHUANG Yu Physical and Chemical Laboratory, Liaoyang Center for Disease Control and Prevention of Liaoning Province (Liaoning Liaoyang 111000)

1006-6586(2017)21-0026-02

TS207.3

A

2017-04-11