黃仲文，曾德智，劉文華，李平

（1.汕頭大學理學院海洋生物研究所，廣東汕頭，515063；2.中國科學院城市環(huán)境研究所，福建廈門，361021）

不同丙氨酸氮比率對中肋骨條藻生理生化的影響

黃仲文1，2，曾德智1，劉文華1，李平1

（1.汕頭大學理學院海洋生物研究所，廣東汕頭，515063；2.中國科學院城市環(huán)境研究所，福建廈門，361021）

本文以不同丙氨酸氮比率（0%，25%，50%，75%和100%）人工海水培養(yǎng)基（ESAW）一次性培養(yǎng)中肋骨條藻（Skeletonema costatum），研究丙氨酸氮對其生理生化指標的影響.結果表明中肋骨條藻不能利用丙氨酸作為氮源進行生長.與對照組相比，高濃度丙氨酸（0.549 mmol/L）對中肋骨條藻有“刺激作用”，促使葉綠素a和最大光合效率均處于較高狀態(tài)，胞內(nèi)ROS含量上升，第9天中性脂肪增加了94%，藻細胞不能正常進入休眠狀態(tài).基于本實驗結果推測，赤潮硅藻中肋骨條藻不能利用游離氨基酸作為氮源進行生長，而且藻細胞胞內(nèi)代謝受到特定氨基酸（如丙氨酸）的影響，在無機氮耗竭的情況下不能進入休眠狀態(tài).本研究有助于了解游離氨基酸對赤潮硅藻生長及浮游植物群落演替的潛在影響，為赤潮防治提供理論依據(jù).

中肋骨條藻；游離氨基酸；丙氨酸；刺激作用

0 引言

隨著工業(yè)廢水和生活污水的排放增加，以及農(nóng)業(yè)化肥和農(nóng)藥的大量使用，近岸水體的有機氮污染不斷加劇.早期觀點認為溶解態(tài)無機氮是海洋浮游植物的主要氮源，但近期越來越多的研究表明浮游植物能夠利用溶解態(tài)有機氮，并且尿素和游離氨基酸（DFAA）在沿海浮游植物總氮吸收的貢獻度高達80%[1].游離氨基酸在海水中的濃度較低，其含量范圍是0.001～0.70 μmol/L[2]，但因其在海水中停留時間非常短[3]，使它成為浮游植物的一種重要有機氮源.

海洋中不同的藻類利用氨基酸的能力各不相同.例如許多甲藻細胞表面含有氨基酸氧化酶，使其可以高效地利用游離氨基酸[4-7]；硅藻利用氨基酸的能力則與地域及時間密切相關.Berg et al[8]研究波羅的海的里加海灣顯示，春季硅藻的生物量與硝氮的吸收利用呈正相關，夏季硅藻與游離氨基酸的吸收利用呈負相關.但Wawrik et al[9]利用15N示蹤技術研究了24種硅藻對無機氮和有機氮的利用情況，也沒有發(fā)現(xiàn)其對標記氨基酸進行吸收利用的證據(jù).對一些典型赤潮硅藻（包括中肋骨條藻）研究也表明其不能利用游離氨基酸進行生長[9-11]，但也有研究顯示某些典型硅藻在一定程度上能夠利用甘氨酸[10，12]和丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等多種氨基酸[13].

游離氨基酸除了作為浮游植物的氮源，可能還可以作為化學信號物質(zhì)，對浮游植物產(chǎn)生影響.Amsler and Iken[14]匯總了對一些游離氨基酸有趨化效應的各種浮游植物.另外，海水游離氨基酸（DFAA）的一個重要來源是浮游植物的排泄（胞外分泌物），其組成和比例因浮游植物種類而有所差異[15]，與生長狀態(tài)也相關[16-18].釋放至胞外的某些氨基酸不但可以反映浮游植物的生理狀態(tài)，還可能作為一種胞外細菌的選擇因子[19]，甚至是使橈足類產(chǎn)生化學感應的信號分子[20-21]或原生生物攝食行為的抑制因子[22].另外，研究顯示海水中最常見的游離氨基酸似乎是絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸[19].夏清艷[23]對中國近海海域（南海、黃海、渤海和東海）的調(diào)查結果顯示谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和天門冬氨酸在游離氨基酸中占有較高比例.Amsler and Iken[14]總結的浮游植物的游離氨基酸趨化因子中，丙氨酸重現(xiàn)次數(shù)最多并在四個門類都出現(xiàn).由此可見，丙氨酸對于大部分浮游植物是比較常見的趨化因子，并可能會影響藻細胞的生長狀態(tài)和生理狀態(tài).

中肋骨條藻（Skeletonema costatum）是一種常見的浮游植物種類，廣泛分布于世界各大洋，尤其是我國沿岸地區(qū)，既是引發(fā)赤潮的主要藻類，同時又是水產(chǎn)上的餌料生物，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起到極其重要的作用.隨著各種人類活動的增加，排放到近岸的各種有機氮源（如氨基酸等）越來越多.這些氨基酸對海洋藻類的影響還有待深入研究.因此，本研究選用丙氨酸作為有機氮氮源，以ESAW人工海水培養(yǎng)基為基礎，添加不同比例的丙氨酸和硝氮來培養(yǎng)中肋骨條藻，探討中肋骨條藻是否能利用丙氨酸作為氮源進行生長，并研究其對高濃度丙氨酸氮的生理生化響應.

1 實驗方法

1.1 藻種和培養(yǎng)方法

本實驗所用藻種中肋骨條藻（Skeletonema costatum）由廈門大學近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室提供.培養(yǎng)期間的溫度為（20±1）℃，光照強度為140 photons·m-2·s-1，光照周期為12 h：12 h.培養(yǎng)液以ESAW人工海水培養(yǎng)基為基礎，丙氨酸氮占總添加氮源的比率分別為0%，25%，50%，75%和100%（另添加相應的100%，75%，50%，25%和0%硝氮氮源），另設一個對照組（不添加氮源的處理組）.為了抑制培養(yǎng)液中細菌的生長繁殖，添加了青霉素和鏈霉素終濃度為10 U mL-1和10 μg mL-1（碧云天，此使用濃度是Chung et al[24]文章的1/10）.中肋骨條藻的接種濃度為5×104cells/mL，光照期間每隔2～3 h晃動并移動位置，使其光照均勻.

1.2 細胞密度

中肋骨條藻的細胞密度使用血球計數(shù)板或100 μL藻類計數(shù)框在顯微鏡下計數(shù).比生長速率μ由以下公式計算[25]：

式中N1和N2分別是t1和t2時間對應的細胞密度.

1.3 葉綠素a

負壓抽慮一定體積的藻液于Whatman GF/C（直徑25 mm，孔徑0.9 μm）玻璃纖維素濾膜，轉(zhuǎn)移至離心管后加入90%丙酮并置于4℃冰箱過夜提取色素.提取液室溫離心（5000 g，5 min）后取上清于DNA/蛋白分析儀（DU530，Beckman，USA）測定630 nm和664 nm的吸光度.葉綠素a濃度根據(jù)Jeffrey and Humphrey[26]公式：Chl a（μg mL-1）＝11.47A664－0.40A630計算.

1.4 葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm

葉綠素熒光參數(shù)利用可調(diào)制式熒光儀Water-PAM（PAM-WATER-ED，Walz，Germany）進行測定.樣品經(jīng)過15 min暗適應后，檢測初始熒光（F0）和最大熒光（Fm），并根據(jù)Kitajima和Butler（1975）的公式計算：

Fm：最大熒光，是在暗適應狀態(tài)下，當PSII的所有反應中心處于完全關閉狀態(tài)并且所有的非光化學過程處于最小時的熒光值；

F0：初始熒光，是在暗適應狀態(tài)下，當PSII的所有反應中心處于完全開放狀態(tài)并且所有的非光化學過程處于最小時的熒光值；

Fv：暗適應狀態(tài)下，當所有的非光化學過程處于最小時的最大可變熒光，F(xiàn)v＝Fm－F0.

1.5 胞內(nèi)ROS

使用2'，7'-Dichlorofluorescein diacetate（DCFH-DA，Sigma，USA）熒光探針測定細胞內(nèi)的ROS相對含量.DCFH-DA通過細胞質(zhì)膜后和胞內(nèi)的酯酶反應生成無熒光的DCFH，DCFH不能透過細胞膜并被細胞內(nèi)的ROS氧化，生成能發(fā)出熒光的DCF.參考Eruslanov and Kusmartsev[27]的方法，將3 mL藻液離心（20℃，3000 g，10 min）去上清后加入3 mL培養(yǎng)液重懸，加入DCFH-DA探針，終濃度為5 μmol/L，37℃黑暗水浴30 min，離心（20℃，3000 g，10 min）后加入3 mL培養(yǎng)液重懸，使用熒光分光光度計（RF-5301）檢測DCF的熒光強度（ex＝504 nm，em＝525 nm）.

1.6 中性脂肪

尼羅紅染液（Nile Red）被廣泛應用于測定微藻的中性脂肪[28-29].本實驗使用尼羅紅（Sigma，USA）熒光探針測定胞內(nèi)中性脂肪的相對含量.參考Liu et al[30]的方法，取4 mL混合均勻的藻液離心（20℃，3000 g，10 min）后加入培養(yǎng)基重懸，重懸后和尼羅紅染液（0.10 mg/mL丙酮）按100/1的體積比混合，充分搖勻，于37℃黑暗水浴10 min后使用熒光分光光度計（RF-5301）檢測Nile Red的熒光強度（ex＝530 nm，em＝575 nm）.

1.7 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)由三次實驗重復得出，數(shù)值表示為平均值±SD（n＝3）.實驗數(shù)據(jù)采用excel2010、Origin7.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析.采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗差異的顯著水平，設置顯著水平α＝0.05.

2 實驗結果

2.1 不同丙氨酸氮比率對中肋骨條藻細胞生長的影響

丙氨酸氮比率對中肋骨條藻的生長密度具有顯著性影響.隨著丙氨酸氮比率的升高，細胞密度呈下降趨勢，并在第7天達到最大細胞密度（圖1）.另外，100%丙氨酸氮比率藻細胞在第5天前的細胞密度都低于對照組；而對照組的藻細胞密度在第3天到達穩(wěn)定期，并持續(xù)至第6天才出現(xiàn)明顯下降，說明100%丙氨酸氮比率藻細胞在5天前生長受到抑制，整體生長速率小于沒有添加氮源的對照組，推測藻細胞可能受到高濃度丙氨酸的抑制.100%丙氨酸氮比率和對照組的藻細胞從接種濃度5×104cells/mL分別生長至53、47×104cells/mL，說明接種的藻細胞內(nèi)或接種的藻液中含有一定量的本底氮源供藻細胞生長.所有處理組的最大比生長速率平均值在1.31～1.56之間，且相互間無統(tǒng)計學意義上的顯著差異（p＜0.05）（圖2A），說明藻細胞的最大比生長速率沒有受到可利用氮源濃度的影響.實驗處理組的最大細胞密度隨著丙氨酸氮比率的升高而顯著下降（p＞0.05），依次為228、164、135、112和53×104cells/mL，100%丙氨酸氮比率與對照組的最大細胞密度無顯著性差異（p＜0.05）（圖2B）.由此說明最大細胞密度與丙氨酸氮源無關，藻細胞不能利用丙氨酸氮進行生長.

圖1 丙氨酸氮比率對中肋骨條藻生長的影響.

圖2 丙氨酸氮比率對中肋骨條藻最大比生長速率（A）和最大細胞密度（B）的影響

2.2 不同丙氨酸氮比率對中肋骨條藻葉綠素a的影響

對照組的葉綠素a含量均顯著低于其它處理組，并隨著培養(yǎng)時間而遞減.各丙氨酸氮比率的葉綠素a含量在第3天無明顯規(guī)律，75%的丙氨酸氮比率葉綠素a顯著升高；第6天和第9天，葉綠素a含量的總體趨勢是隨著丙氨酸氮比率升高而下降，推測是培養(yǎng)液中可利用于合成葉綠素a的氮源濃度隨著丙氨酸氮比率升高而下降（圖3）.

圖3 丙氨酸氮比率對中肋骨條藻葉綠素a的影響.

2.3 不同丙氨酸氮比率對中肋骨條藻PSⅡ最大光合效率Fv/Fm的影響

丙氨酸氮比率對藻細胞的PSⅡ最大光合效率Fv/Fm影響不是特別顯著.與0%丙氨酸氮比率（100%硝氮氮源）相比，第6天25%和50%丙氨酸氮比率的Fv/Fm略高，而75%和100%丙氨酸氮比率的Fv/Fm分別顯著下降了3%和4%.而第9天（衰亡期），各丙氨酸氮比率的Fv/Fm與第3、6天相比整體下降，并隨著丙氨酸氮比率升高而大幅度顯著下降.第9天25%、50%、75%、100%丙氨酸氮比率的Fv/Fm與0%丙氨酸氮比率相比，分別被抑制了7%、22%、23%和17%.另外，對照組的Fv/Fm隨著培養(yǎng)時間而顯著下降（圖4）.

圖4 丙氨酸氮比率對中肋骨條藻光系統(tǒng)Ⅱ最大光合效率Fv/Fm的影響.所有數(shù)據(jù)由三次實驗重復得出，數(shù)值表示為平均值±SD（n＝3），各處理組數(shù)據(jù)之間進行顯著性分析（p＜0.05）.

2.4 不同丙氨酸氮比率對中肋骨條藻胞內(nèi)ROS的影響

丙氨酸氮比率在第3天對中肋骨條藻的胞內(nèi)ROS有顯著性影響，50%、75%和100%丙氨酸氮比率的胞內(nèi)ROS熒光強度與0%丙氨酸氮比率相比，分別增加了1.42、1.44和2.79倍.但是，在第6天和第9天，只有100%丙氨酸氮比率的胞內(nèi)ROS熒光強度與0%丙氨酸氮比率相比有顯著升高，而其它丙氨酸氮比率與之間無顯著性差異.另外，對照組的ROS熒光強度一直維持在70～101（圖5）.

圖5 丙氨酸氮比率對中肋骨條藻胞內(nèi)ROS含量的影響.所有數(shù)據(jù)由三次實驗重復得出，數(shù)值表示為平均值±SD（n＝3），各處理組數(shù)據(jù)之間進行顯著性分析（p＜0.05）.

2.5 不同丙氨酸氮比率對中肋骨條藻胞內(nèi)中性脂肪的影響

不同丙氨酸氮比率的胞內(nèi)中性脂肪在第3天無顯著性差異（圖6），Nile Red熒光強度在564～763之間，對照組則顯著增加了1.12倍.第6天和第9天，中肋骨條藻的胞內(nèi)中性脂肪隨著丙氨酸氮比率的增加呈上升趨勢，并且都在100%丙氨酸氮比率達到最高值.另外，對照組的胞內(nèi)中性脂肪在第3、6、9天基本保持不變，維持在1336～1430.

圖6 丙氨酸氮比率對中肋骨條藻胞內(nèi)中性脂肪的影響.所有數(shù)據(jù)由三次實驗重復得出，數(shù)值表示為平均值±SD（n＝3），各處理組數(shù)據(jù)之間進行顯著性分析（p＜0.05）.

3 討論

胡晗華等人報道中肋骨條藻在0.0882、0.882和2.646 mmol/L硝氮濃度條件下比生長速率差異不大[31]，而茍彬等人報道中肋骨條藻在硝氮濃度高于80 μmol/L時，初始硝氮濃度對比生長速率影響很小[32].本實驗結果與之類似，各處理組的最大比生長速率無顯著性差異（圖2A）.75%丙氨酸氮比率對應的硝氮濃度為137.25 μmol/L（＞80 μmol/L），0%、25%、50%和75%丙氨酸氮比率的生長狀態(tài)基本相同.而100%丙氨酸氮比率和對照組除了最大比生長速率和其它處理組無顯著差異外，其它時間段的比生長速率都處于較低水平.各丙氨酸氮比率（0%、25%、50%和75%）的生長狀態(tài)基本一致，從第1天開始進入對數(shù)生長期，在第7天達到最高細胞密度（75%是第6天），然后進入衰亡期.各丙氨酸氮比率的葉綠素a和Fv/Fm都沒有明顯變化規(guī)律，只在第9天隨著丙氨酸氮比率升高而下降（與可利用的硝氮比率呈正相關）.同時，胞內(nèi)ROS含量無明顯變化規(guī)律（圖5）.各丙氨酸氮比率中性脂肪均隨著培養(yǎng)時間延長而增加.

然而，無可利用氮源的兩個處理組（100%丙氨酸氮比率和對照組）的最大細胞密度均約為接種細胞密度的10倍，可能原因是接種藻液含有的氮營養(yǎng)或接種藻細胞含有氮儲備.兩者的最大細胞密度無顯著性差異，但葉綠素a，F(xiàn)v/Fm，ROS和中性脂肪含量相差很大.

許多研究表明氮限制是誘導硅藻形成休眠孢子的最重要因素，也是孢子形成的必需條件[33].孫琳等人的研究表明培養(yǎng)液中硝氮的初始濃度對赤潮藻扁面角毛藻（Chaetoceros compressus）休眠孢子的形成時間有顯著影響[34].氮的初始濃度越低，休眠孢子出現(xiàn)的時間越早；反之，休眠孢子出現(xiàn)的時間越晚.對照組的藻細胞胞內(nèi)ROS一直維持在較低水平（胞內(nèi)代謝活動緩慢），胞內(nèi)較高含量的中性脂肪以及不斷降解的葉綠素是維持藻細胞緩慢代謝的主要能源，F(xiàn)v/Fm也隨著葉綠素含量的下降而下降，并顯著低于其它處理組.由此可推測對照組藻細胞在第3天達到穩(wěn)定期后進入了休眠狀態(tài)（休眠細胞）.然而，無可利用氮源的100%丙氨酸氮比率藻細胞卻沒有進入休眠狀態(tài)，胞內(nèi)ROS從第3天的875（相對熒光量）上升至第9天的2242（相對熒光量），中性脂肪從第3天的633（相對熒光量）上升至第9天的2772（相對熒光量）；同樣無可利用氮源的對照組的胞內(nèi)ROS和中性脂肪含量一直維持恒定.兩者的中性脂肪和ROS有較好的正相關關系，推測100%丙氨酸氮比率藻細胞由于受到較高濃度丙氨酸（0.549 mmol/L）的“刺激作用”，光合作用（葉綠素a含量、Fv/Fm）等胞內(nèi)代謝活躍，但由于胞內(nèi)缺乏氮源而產(chǎn)生絮亂，胞內(nèi)ROS含量不斷升高，導致中性脂肪的大量累積.丙氨酸的“刺激作用”還表現(xiàn)在第3天的胞內(nèi)ROS含量，50%、75%和100%丙氨酸氮比率的ROS顯著高于0%和25%.

植物和動物在各種脅迫條件下累積丙氨酸是一種普遍現(xiàn)象，丙氨酸可能是一種細胞表達的普遍第一應力信號[35].體內(nèi)和體外實驗都表明甘氨酸和丙氨酸可以刺激腎細胞應激蛋白基因（HSP70）的表達，保護細胞免受應激損傷[36]；L-丙氨酸還可以誘導植物懸浮培養(yǎng)細胞V.labrusca發(fā)生程序性死亡[37].另外，大量研究也表明硅藻細胞氨基酸含量與胞外氨基酸含量，生長周期等密切相關[16，18，38].本研究中，100%丙氨酸氮培養(yǎng)的藻細胞處于氮缺乏或氮饑餓狀態(tài)，理論上應該與對照組一樣進入休眠狀態(tài).但由于添加了高濃度的丙氨酸（0.549 mmol/L），可能會促使藻細胞累積大量的丙氨酸而使藻細胞ROS升高，中性脂肪累積等應激反應（圖5，6），從而使藻細胞無法與對照組的藻細胞一樣進入休眠狀態(tài).另外，丙氨酸的刺激作用可能也是50%、75%和100%丙氨酸氮比率的胞內(nèi)ROS在第3天比0%和25%高的原因.

總之，中肋骨條藻不能利用丙氨酸作為氮源進行生長，而較高濃度的丙氨酸氮（0.549 mmol/L）可能對中肋骨條藻產(chǎn)生“刺激作用”，使其在無可利用氮源情況下不能進入休眠狀態(tài).丙氨酸對中肋骨條藻的具體作用機理需要進一步研究，但近岸海域有機氮污染加劇使某些游離氨基酸升高，將可能會對中肋骨條藻等浮游植物的胞內(nèi)代謝產(chǎn)生干擾，影響其正常生理活動.

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Effect of Different Alanine Nitrogen Ratio on the Physiological Response of Skeletonema Costatum

HUANG Zhongwen,ZENG Dezhi,LIU Wenhua,LI Ping
（Marine BiologyInstitute,College of Science,Shantou University,Shantou 515063,Guangdong,China）

Skeletonema costatumwerebatchculturedinartificialseawater（ESAW）with different alanine nitrogen ratio（0%，25%，50%，75%，and 100%）,tostudythe effects ofalanine on its physiological and biochemical responses.The results indicate that Skeletonema costatum can't grow with alanine as nitrogen source.Compared with the control group,high alanine concentration（0.549 mmol/L）“stimulate”Skeletonema costatum,induces higher chlorophyll a, maximum photosynthetic efficiency and intracellular ROS,and neutral fat content increased by 94%in day 9,resulting in abnormal dormant state.Based on our experimental results,it is speculated the HAB diatoms Skeletonema costatum can't growth with free amino acids. Furthermore,Skeletonema costatum cellular metabolism might be affected by specific amino acids（such as alanine）,and could not access to dormant state in the case of inorganic nitrogen depletion.This results give a better understanding of the effect of free amino acids on the growth of HAB diatoms and phytoplankton community succession,and provides a theoretical basis for the basis for the prevention and control of HAB.

Skeletonema costatum;free amino acids;alanine;stimulation

Q94

A

1001-4217（2016）04-0064-10

2014-11-06

黃仲文（1985—），男，博士研究生.

李平（1981—），男，副教授，博士.E-mail：liping@stu.edu.cn

廣東省科技計劃項目（2011B050300026）；廣東省自然科學基金資助項目（S2011030005257，2016A030313065）