文/孔祥瑞

（黑龍江立高儀器設(shè)備有限公司）

阪崎腸桿菌檢測方法的研究進展

文/孔祥瑞

（黑龍江立高儀器設(shè)備有限公司）

阪崎腸桿菌是能夠?qū)е滦律鷥簢?yán)重疾病甚至死亡的條件致病菌。目前，該菌已經(jīng)從多種食品及環(huán)境中檢出。因此，建立快速、操作簡便、特異性好、靈敏度高的檢測方法對食品及加工環(huán)境的安全監(jiān)控具有非常重要的意義。研究了國內(nèi)外阪崎腸桿菌檢測方法的進展情況，建立快速、簡便、靈敏度高的阪崎腸桿菌檢測系統(tǒng)是未來發(fā)展的需要。

阪崎腸桿菌；檢測方法；研究進展

阪崎腸桿菌是以日本細菌學(xué)家Riichi Sakazakii的名字命名的，是腸桿菌科腸桿菌屬的一個新種，屬于革蘭氏陰性桿菌，至2006年該菌已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了16 個生物型。該菌廣泛存在于自然界中，在奶粉、肉制品、谷物、蔬菜、水果等多種食品中分離出了阪崎腸桿菌。此菌是一種條件致病菌，感染對象多是嬰兒，尤其是早產(chǎn)、低重兒和免疫力低下的新生兒[1]。它可引起新生兒腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎等重疾，雖發(fā)病率不高，但死亡率可達到50%～80%。根據(jù)疾病預(yù)防控制中心（CDC）報告，全球每年約有6 例阪崎腸桿菌報告病例，其中大部分感染病例發(fā)生在發(fā)達國家。國內(nèi)外學(xué)者針對阪崎腸桿菌的安全監(jiān)控研發(fā)了大量的檢測方法。與其它食源性致病菌相比，阪崎腸桿菌的常規(guī)檢測方法不夠成熟，對于該菌的鑒定是以 TSA 平板上產(chǎn)生的黃色素為基礎(chǔ)，只有在 TSA 平板上產(chǎn)生了黃色素，才能夠進行下一步的一系列確認試驗[2]。然而，黃色素的產(chǎn)生并不是該菌所特有的，研究表明，自然界中存在一些其它菌也可以產(chǎn)生黃色素，因此該方法特異性差。因此，研究建立阪崎腸桿菌快速、特異性和靈敏度高，并且經(jīng)濟高效的檢測方法十分重要。

1 傳統(tǒng)的檢驗方法

1.1 常規(guī)檢驗方法

傳統(tǒng)的食品中阪崎腸桿菌的檢測方法是GB 4789.40-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》，此法與ISO方法相似，包括選擇性前增菌、分離、生化鑒定，檢測步驟比較復(fù)雜，周期較長，需要5～7天才能得到結(jié)果，不利于檢測該菌對食品的污染情況，且準(zhǔn)確性和特異性不高，容易導(dǎo)致結(jié)果假陽和假陰性。

1.2 常規(guī)方法的改進

為了避免出現(xiàn)假陽和假陰性的結(jié)果，同時提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，研究人員改進了分離培養(yǎng)基。Leuschner等[3]在培養(yǎng)基中加入4-甲基傘形酮-α-D-葡萄糖苷作為熒光底物，阪崎腸桿菌在生長繁殖時會產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，從而提高特異性。Muytjens等[4]鑒定了 129 株阪崎桿菌分離株的α-葡萄糖苷酶活性，100%為陽性株。在培養(yǎng)基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚-α，D-吡喃葡糖苷作為α-葡萄糖苷酶指示劑，開發(fā)了新的分離培養(yǎng)基。Leuschner和Bew[5]對 ISO檢測方法稍作修改，對阪崎腸桿菌進行篩檢，在歐洲8 個國家的16 個實驗室間進行驗證。阪崎腸桿菌在NA+α-MUG平板上生長，在日光下菌落呈現(xiàn)鮮黃色，在紫外光下呈現(xiàn)藍/紫色熒光?？梢删溆肁PI20E進行生化鑒定。

2 分子生物學(xué)方法

2.1 PCR 檢測技術(shù)

P C R技術(shù)已經(jīng)在生命科學(xué)的許多領(lǐng)域有應(yīng)用，包括單重PCR、多重PCR、實時PCR技術(shù)。Lehner 等[6]用PCR技術(shù)對15 株阪崎腸桿菌進行檢測。Keyser等[7]2003年評估厭氧污泥床技術(shù)處理葡萄酒廠廢水能力時，首次報道了阪崎腸桿菌快速 PCR檢測法。高旗利等[8]對菌體16S和23S rDNA保守序列通用引物的利用，對 6 株阪崎腸桿菌16～23S rRNA序列進行擴增、測序，建立奶粉中該菌PCR檢測法。PCR技術(shù)靈敏度高、快速[9]，但需要的儀器設(shè)備昂貴、電泳繁瑣，對檢測人員的技術(shù)要求較高。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是Notomi等[10]在2000年開發(fā)的一種新型恒溫核酸擴增方法，此法靈敏度高、耗時短、方法簡便[11～12]。胡連霞等[13]采用改良的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法，快速檢測出嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌。Hu等[14]對阪崎腸桿菌的16S～23S rRNA基因區(qū)間設(shè)計引物，用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)對阪崎腸桿菌人工污染的奶粉進行檢測，結(jié)果表明此法靈敏度、特異性都高于PCR技術(shù)。

2.3 核酸探針技術(shù)

德國Vermicon AG公司利用核酸探針技術(shù)，設(shè)計了細菌rRNA特殊區(qū)域熒光標(biāo)記，建立了商品化檢驗及鑒定系統(tǒng)。Lehner等[15]根據(jù)德國Vermicon AG公司建立的系統(tǒng)，使用落射熒光顯微鏡可觀察到阪崎腸桿菌發(fā)出的特異性紅光，使該菌非常容易被鑒定。Liu等[16]設(shè)計了10 對寡聚核苷酸探針和2 對特異性PCR引物。試驗結(jié)果表明，PCR方法和探針法用于阪崎腸桿菌檢測時均為陽性。

3 免疫學(xué)檢測方法

3.1 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附是把免疫學(xué)和現(xiàn)代測試技術(shù)相結(jié)合而建立的一種超微量測定方法。石曼[17]初步研究了阪崎腸桿菌的免疫分析方法，制備了高效價、高特異性的阪崎腸桿菌多克隆抗體。通過優(yōu)化免疫分析條件，建立一種快捷、方便且實用的間接酶聯(lián)免疫檢測阪崎腸桿菌的方法。汪琳等[18]制備了抗阪崎腸桿菌單克隆抗體，并初步建立了ELISA檢測方法。

3.2 免疫磁性微球珠富集技術(shù)

金燕飛等[19]利用陽離子磁珠捕捉乳粉中的阪崎腸桿菌，將特異的阪崎腸桿菌多克隆抗體結(jié)合到磁珠微球上，磁珠捕獲同時富集細菌，此法大大縮短阪崎腸桿菌檢測周期，提高效率，與傳統(tǒng)法相比，操作簡單、靈敏度高、檢測周期短，但是成本有所增加。

3.3 免疫熒光技術(shù)

支援等[20]采用熒光生物標(biāo)記物標(biāo)記免疫磁珠富集的阪崎腸桿菌，其中熒光生物標(biāo)記物為量子點。結(jié)果顯示整個檢測過程只需要2 小時，檢出限較低，約為100 CFU/mL，且時間短、靈敏度高、特異性好。

4 計算機網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)模擬智能計算系統(tǒng)

Iversen等[21]利用計算機網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的智能計算系統(tǒng)和多層感知器ANN技術(shù)，對阪崎腸桿菌分離株的生化特征和16S rDNA序列進行分析。以計算機為基礎(chǔ)的分析方法可降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜性和維數(shù)，提高菌種鑒定系統(tǒng)速度及可靠性。

5 小結(jié)

快速、操作簡便、靈敏度高、特異性高的檢測技術(shù)是食品中病原性微生物檢測的主要發(fā)展方向。國內(nèi)外大量的阪崎腸桿菌研究數(shù)據(jù)表明，PCR技術(shù)是未來阪崎腸桿菌快速檢測方法的研究基礎(chǔ)和方向。

[1] 劉艷艷，柳增善，盧士英，等. 滅菌乳中活阪崎腸桿菌PMA-PCR檢測方法的建立[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（2）：65-69.

[2] Iversen C，F(xiàn)orsythe S J.Comparison of media for the isolation of Enterobacter sakazakii[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（1）：48-52.

[3] Leuschner R G K，Baird F，Donald B，et al. A medium for presumptive detection of Enterobacter sakazakii in infant formula[J].Food Microbiology，2004，21（96）：133-139.

[4] Muytjens H L，van der Ros-van de Repe J，van Druten H A. Enzymatic profiles of Enterobacter sakazakii and related species with special reference to the alphaglucosidase reaction and reproducibility of the test system[J]. Journal of Clinical Microbiology，1984，20（4）：684-686.

[5] Leuschner R G，Bew J. A medium for the presumptive detection of Enterobacter sakazakii in infant formula：interlaboratory study[J]. Journal of AOAC International，2004，87（3）：604-613.

[6] Lehner A，Tasara T，Stephan R. 16S rRNA gene based analysis of Enteuobacter sakazakii strains from different sources and development of a PCR assay for identification[J]. BMC Microbiology，2004，4（1）：1-7.

[7] Keyser M，Witthuhn R C，Ronquest L C，et al. Treatment of winery effluent with upflow anaerobic sludge blanket（UASB）-granular sludges enriched with Enterobacter sakazakii[J]. Biotechnology Letters，2003，25（22）：1893-1898.

[8] 高旗利，張霞，羅茂凰，等. 奶粉中阪崎腸桿菌 PCR檢測方法研究[J]. 檢驗檢疫科學(xué)，2005，15（4）：4-8.

[9] Orlandi P A，Lampel K A. Extraction-free，filter-based template preparation for rapid and sensitive PCR detection of pathogenic parasitic protozoa[J]. Journal of Clinical Microbiology，2000，38（6）：2271-2277.

[10] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63.

[11] Mori Y，Kitao M，Tomita N，et al. Realtime turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2004，59（2）：145-157.

[12] Suzuki R，Yoshikawa T，Ihira M，et al.Development of the loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of cytomegalovirus DNA[J].Journal of Virological Methods，2006，132（1-2）：216-221.

[13] 胡連霞，張偉，張先舟，等. 改良環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌[J]. 微生物學(xué)報，2009，49（3）：378-382.

[14] Hu L，Zhang W，Zhang X，et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Enterobacter sakazakii in powdered infant formula[J].Acta Microbiologica Sinica，2009，49（3）：378-382.

[15] Lehner A，Nitzsche S，Breeuwer P，et al.Comparison of two chromogenic media and evaluation of two molecularbased identification systems for Enterobacter sakazakiidetection[J]. BMC Microbiology，2006，23（6）：15.

[16] Liu Y，Gao Q，Zhang X，et al. PCR and oligonucleotide array for detection of Enterobacter sakazakii in infant formula[J].Molecular & Cellular Probes，2006，20（1）：11-17.

[17] 石曼. 食品中阪崎腸桿菌酶聯(lián)免疫檢測方法研究：碩士論文[D]. 天津：天津科技大學(xué)，2011.

[18] 汪琳，李勐偉，刑佑尚，等. 阪崎腸桿菌單克隆抗體制備及ELISA檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（12）：52-55.

[19] 金燕飛，鄭培，王海明，等. 應(yīng)用陽離子磁珠捕集法快速檢測奶粉中阪崎腸桿菌[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2009，9（19）：3741-3743.

[20] 支援，孟瑾，鄭小平，等. 一種快速檢測阪崎腸桿菌的新方法免疫磁性分離熒光標(biāo)記[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2010，33（5）：231-233.

[21] Iversen C，Lancashire L，Waddington M，et al. Identification of Enterobacter sakazakii from closely related species：The use of Artificial Neural Networks in the analysis of biochemical and 16S rDNA data[J]. BMC Microbiology，2006，13（6）：28.

孔祥瑞（1982-），女，本科，研究方向為乳制品檢測化驗。

2017-06-20）