王勇，王釗

（1.漳河上游管理局水文水環(huán)境中心，河北邯鄲056006；2.海河流域水資源保護(hù)局水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，天津300170）

固相萃取-高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法在北方河流水體氯霉素類抗生素測(cè)定中的應(yīng)用

王勇1，王釗2

（1.漳河上游管理局水文水環(huán)境中心，河北邯鄲056006；2.海河流域水資源保護(hù)局水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，天津300170）

建立了固相萃取-高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法，同時(shí)測(cè)定水中的4種氯霉素類抗生素（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺）殘留，采用MRM掃描方式在正/負(fù)模式下，在10 min內(nèi)完成對(duì)氯霉素類抗生素的分析，該方法線性范圍為1～100μg/L，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，實(shí)際水樣加標(biāo)回收率為92.8%～117.48%。利用該方法對(duì)北方河流水樣進(jìn)行采樣調(diào)查，其中氟苯尼考檢出率較高為26%，達(dá)526.36 ng/L。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，具有一定的推廣價(jià)值。

固相萃取；質(zhì)譜；氯霉素；水質(zhì)監(jiān)測(cè)；北方河流

氯霉素類（CAPs）藥物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，這類藥物具有廣譜抗菌能力，常用于預(yù)防與治療動(dòng)物疾病[1]，其中氯霉素曾在動(dòng)物和人體上大量使用，但它會(huì)抑制人體骨髓造血功能從而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[2]，已被禁止使用。歐盟、美國(guó)等均在食品法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”（Zero tolerance），即不得檢出[3]。

甲砜霉素和氟苯尼考屬于新型氯霉素類廣譜抗菌藥物，為氯霉素的替代藥物，因其極佳的治療效果正越來越廣泛地被應(yīng)用于治療包括水產(chǎn)養(yǎng)殖在內(nèi)的動(dòng)物疾病。同時(shí)，其對(duì)動(dòng)物有胚胎毒性，用藥后還會(huì)出現(xiàn)厭食、腹瀉等不良反應(yīng)，對(duì)消費(fèi)者的危害也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)該類藥物殘留的方法主要有微生物法、免疫分析方法和儀器分析方法、高效液相色譜法[4-6]，其中LC/MS成為確證氯霉素殘留分析方法的發(fā)展趨勢(shì)。

針對(duì)這些情況，建立了固相萃取-高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法以測(cè)定水中的4種氯霉素類抗生素（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺），優(yōu)化了前處理?xiàng)l件和分離檢測(cè)條件，并應(yīng)用于實(shí)際水樣的檢測(cè)分析。該方法具有操作簡(jiǎn)單，試劑少，靈敏度高、定量準(zhǔn)確，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

1 試驗(yàn)材料和條件

1.1 材料

甲醇購(gòu)自賽默飛世爾公司，色譜純，純度＞99.9%；乙腈購(gòu)自J.T.baker公司，色譜純，純度＞99.9%；甲酸購(gòu)自J.T.baker公司，色譜純，純度＞98.0%；氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇為溶劑，配置濃度為100 mg/L。

1.2 條件

（1）液相條件。柱溫為35℃，流動(dòng)相為乙腈和0.01%甲酸/水，流動(dòng)梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（ESI），檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，干燥氣為氮?dú)?，干燥氣溫度?50℃，干燥氣流速為10 L/min。氯霉素類抗生素質(zhì)譜分析的條件參數(shù)，見表2。

表2 氯霉素類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

依次用10 mL甲醇和10 mL純水，以3 mL/min流速活化HLB固相萃取小柱，取400 mL水樣調(diào)節(jié)pH為3～4，以10 mL/L的流速上樣，用6 mL甲醇分3次洗脫小柱，洗脫液在40℃由氮吹至近干，用乙腈/水（2∶8體積比）定容至1 mL，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取方法優(yōu)化

（1）固相萃取柱選擇。C18為反相萃取柱，以十八烷基鍵合硅膠為填料，通過加標(biāo)回收率試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C18小柱對(duì)4種目標(biāo)物質(zhì)的回收率均較低，約為35%～55%。而Oasis HLB固相萃取小柱以N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯苯共聚物為填料，通過加標(biāo)回收率試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HLB小柱對(duì)4種目標(biāo)物質(zhì)的回收率均在90%以上，因此選用HLB小柱作為固相萃取柱。

（2）洗脫溶劑和體積選擇。研究了4種甲醇∶水配比（分別為100∶0、90∶10、80∶20、70∶30）與4種洗脫體積（依次為2×2、3×2、4×2和5×2 mL）組合對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的洗脫效果。其中，洗脫溶液為100%甲醇且體積為3×2 mL時(shí)洗脫效果最佳，各目標(biāo)物質(zhì)的回收率最高。

2.2 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

氯霉素類化合物因含有酚羥基而適合在ESI源負(fù)離子模式下離子化，其產(chǎn)生的母離子為［M-H]－，代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺則適合在ESI源正離子模式下離子化。

試驗(yàn)在干燥氣氮?dú)鉁囟葹?50℃、流速為10L/min的條件下，在電噴霧正離子模式下，對(duì)100 μg/mL的氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其質(zhì)子化分子離子[M+H]+；在電噴霧負(fù)離子模式下，再分別對(duì)100 μg/mL的甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其質(zhì)子化分子離子[M-H]－，然后以這些分子離子作為母離子對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，最后選取豐度較強(qiáng)的兩對(duì)離子，優(yōu)化其錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。

采用正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜采集時(shí)，通常需在溶液中加入甲酸使分析物容易質(zhì)子化而帶上正電荷，但是使用甲酸后甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的負(fù)離子模式采集會(huì)受到抑制。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以乙腈和水作為流動(dòng)相，各組分均能得到較好的分離，在質(zhì)譜上均有較強(qiáng)的響應(yīng)，并且峰形好看，與已有報(bào)道現(xiàn)象相同[7，8]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以乙腈/水（2∶8體積比）逐級(jí)（0.1、1、10、50、75、100 μg/L）稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在試驗(yàn)條件下進(jìn)樣（10 μL），結(jié)果經(jīng)線性回歸，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)液濃度（x）為橫坐標(biāo)繪圖，獲得氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的線性方程。4種氯霉素類抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及回收率，見表3。

表34種氯霉素類抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及回收率

2.4 實(shí)際水樣分析

采用SPE-HPLC/MS/MS方法對(duì)北方河流150個(gè)站點(diǎn)河水進(jìn)行了采樣調(diào)查，實(shí)際水體加標(biāo)回收率為92.8%～117.48%。試驗(yàn)結(jié)果顯示，河水中氟苯尼考檢出率最高為26%，濃度為0～526.36 ng/L。

氟苯尼考被應(yīng)用于治療包括水產(chǎn)養(yǎng)殖在內(nèi)的動(dòng)物疾病。檢出濃度較高的地點(diǎn)，附近可能有養(yǎng)殖場(chǎng)的存在，由于下雨沖刷隨地表徑流進(jìn)入河道。從季節(jié)來看，8和11月檢出率較高，可能由于養(yǎng)殖場(chǎng)的管理不善和正值投藥時(shí)間。

3 結(jié)語

氯霉素類抗生素的監(jiān)測(cè)多為高效液相色譜檢測(cè)。在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜只是依靠保留時(shí)間定性，對(duì)于多種物質(zhì)的檢測(cè)需要通過對(duì)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間分離；對(duì)于復(fù)雜的水樣來說，其有可能出現(xiàn)重疊峰，進(jìn)而會(huì)影響定量。而高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法，是通過物質(zhì)的母離子和子離子來定性，每種物質(zhì)都有特定的組合，能更好地適應(yīng)復(fù)雜的水樣定量監(jiān)測(cè)。

[1]陳君義，孫慧宇，舒永蘭，等.同位素內(nèi)標(biāo)-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留[J].化學(xué)分析計(jì)量，2011，20（2）：46-48．

[2]Masahiko T，Shigeki D，Taketoshi N.Determination of chlor?amphenicol residues in fish meats by liquid chromatofra?phy-atmospheric pressure photoionization mass spectromety [J].Journal of Chromatofraphy A，2003，1011：67-75.

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X832

B

1004-7328（2016）06-0065-03

10.3969/j.issn.1004-7328.2016.06.021

2016—07—21

王勇（1966—），男，高級(jí)工程師，主要從事水文水資源管理、水質(zhì)監(jiān)測(cè)工作。