陳 鵬，汪 靜，張紅盼，吳 玥，劉 剛，周本宏，2#(.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060;2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢43007)

藥物體外肝代謝的研究方法Δ

陳 鵬1＊，汪 靜1，張紅盼1，吳 玥1，劉 剛1，周本宏1，2#(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060;2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢430071)

目的:為藥物體外肝代謝研究方法在新藥研發(fā)中的應(yīng)用提供參考。方法:以“藥物代謝”“體外肝代謝”“肝微粒體體外溫孵法”“肝細(xì)胞體外溫孵法”“肝灌流技術(shù)”“肝組織切片技術(shù)”“基因重組P450酶系”“Drugmetabolism”“Livermetabolism in vitro”“Metabolism of liverm icrosome in vitro”“Liver perfusion technique”“Liverbiopsy technique”“Recombination genetic cytochrome P450”等為關(guān)鍵詞，組合查詢1996年10月-2017年4月在PubMed、Web of Science、中國知網(wǎng)、中國生物醫(yī)學(xué)等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)體外肝代謝研究方法進(jìn)行綜述。結(jié)果與結(jié)論:共檢索到相關(guān)英文文獻(xiàn)220余篇、中文文獻(xiàn)750余篇，其中有效文獻(xiàn)30篇。常見的體外肝代謝研究方法有肝微粒體體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、肝灌流技術(shù)、肝組織切片技術(shù)、基因重組P450酶系等。藥物體外肝代謝不能全面反映體內(nèi)藥物的綜合代謝情況，與體內(nèi)的真實(shí)代謝情況存在差異，今后需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等方法來完善藥物在體內(nèi)外的藥物代謝轉(zhuǎn)運(yùn)研究;目前肝灌流技術(shù)和基因重組P450酶系等體外肝代謝研究方法對(duì)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)操作成本、數(shù)據(jù)處理技術(shù)等要求較高，其運(yùn)用和推廣仍然受到一定的約束和限制，今后需建立簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、高效的科學(xué)技術(shù)方法和手段。

體外肝代謝;肝微粒體體外溫孵法;肝細(xì)胞體外溫孵法;肝灌流技術(shù);肝組織切片技術(shù);基因重組P450酶系;新藥開發(fā)

目前對(duì)于傳統(tǒng)藥物及其制劑的代謝研究一般都偏向于體內(nèi)研究，但是在體內(nèi)代謝研究過程中由于藥物在生物體內(nèi)分布廣泛，代謝轉(zhuǎn)化極易受到各種臟器和多種酶系的干擾，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)濃度較低，增加了機(jī)體藥物代謝、分離和檢測的難度，這對(duì)于藥物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的研究是非常不利的[1-2]。而體外代謝法能克服體內(nèi)眾多因素的干擾，可快速方便地控制代謝條件，易于代謝產(chǎn)物的分離、提取;另外，對(duì)于毒性大、體內(nèi)代謝清除率低、檢測手段靈敏度低的藥物，體外代謝法更是良好的研究手段。肝是血流量很高的器官，藥物的代謝大多在肝進(jìn)行，主要包括藥物的Ⅰ相氧化和Ⅱ相偶聯(lián)反應(yīng)。藥物經(jīng)上述反應(yīng)后性質(zhì)發(fā)生變化，其藥效/毒性可能加強(qiáng)或減弱，體外肝代謝法成了藥物體外代謝研究的主要技術(shù)和方法。常見的體外肝代謝研究方法有肝微粒體體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、肝灌流技術(shù)、肝組織切片技術(shù)、基因重組P450酶系等[3-4]，廣泛應(yīng)用于藥物毒理學(xué)、藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)的研究，根據(jù)不同的要求和目的加以選擇和利用，可達(dá)到理想效果。筆者以“藥物代謝”“體外肝代謝”“肝微粒體體外溫孵法”“肝細(xì)胞體外溫孵法”“肝灌流技術(shù)”“肝組織切片技術(shù)”“基因重組P450酶系”“Drugmetabolism”“Livermetabolism in vitro”“Metabolism of liver m icrosome in vitro”“Liver perfusion technique”“Liver biopsy technique”“Recombination genetic cytochrome P450”等為關(guān)鍵詞，組合查詢1996年10月-2017年4月在PubMed、Web of Science、中國知網(wǎng)、中國生物醫(yī)學(xué)等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果，共檢索到相關(guān)英文文獻(xiàn)220余篇、中文文獻(xiàn)750余篇，其中有效文獻(xiàn)30篇。現(xiàn)對(duì)常用的體外肝代謝研究方法進(jìn)行綜述，以期為藥物體外肝代謝研究方法在新藥研發(fā)中的應(yīng)用提供參考。

1 肝微粒體體外溫孵法

肝微粒體體外溫孵法是一種先利用差速離心技術(shù)制備得到肝微粒體，然后再人工模擬體內(nèi)生理溫度和環(huán)境等條件下輔以氧化還原型輔酶混合得到的生化反應(yīng)體系[5]。此體系制備簡單、代謝時(shí)間短、易于重現(xiàn)，方便大量操作以積累代謝樣品供結(jié)構(gòu)研究。

1.1 運(yùn)用肝微粒體體外溫孵法進(jìn)行藥物體外代謝途徑研究

JiHY等[6]選擇抗過敏藥物紫堇堿(Corydaline)作為體外代謝底物，運(yùn)用肝微粒體體外溫孵法對(duì)Corydaline體外代謝途徑進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，Corydaline體外肝微粒體代謝主要有M 1(Yuanhunine)、M 2(9-O-desmethylcorydaline)、M 3(Isocorybulbine)、M 4(Corybulbine)、M 5(9，10-di-O-desmethylcorydaline)、M 6(2，10-di-O-desmethylcorydaline)、M 7(3，10-di-O-desmethylcorydaline)、M 8(Hydroxyyuanhunine)、M 9(Hydroxycorydaline)等9種代謝產(chǎn)物;而以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)其肝細(xì)胞孵育代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該代謝途徑下Corydaline的主要代謝產(chǎn)物只有M 1、M 5、M 6及M 9?？梢钥闯?，代謝酶系在肝微粒體和肝細(xì)胞中的分配和構(gòu)成有一定的差異，即相同的物質(zhì)在不同的途徑下由于代謝酶系的不同得到的代謝產(chǎn)物也會(huì)有所差異。因此，對(duì)于確認(rèn)與體內(nèi)代謝情況一致的體外代謝途徑目前依舊是一個(gè)難題。

1.2 運(yùn)用肝微粒體體外溫孵育法進(jìn)行藥物體內(nèi)代謝清除研究

肝微粒體體外溫孵育法已廣泛應(yīng)用于預(yù)測藥物體內(nèi)代謝清除等方面的研究。一般是先通過酶促動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)測定藥物的米氏常數(shù)(Km)等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，然后結(jié)合相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)軟件來推測藥物在體內(nèi)的清除率。

邸欣等[7]運(yùn)用肝微粒體體外溫孵育體系對(duì)大黃素在大鼠體內(nèi)代謝清除率進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，大黃素在♀、♂大鼠肝微粒體中的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在顯著差異，其中♀鼠肝微粒體的最大反應(yīng)速率約為♂鼠的2倍，而♂鼠肝微粒體的Km又小于♀鼠，說明相比于♂鼠肝微粒體，♀鼠肝內(nèi)催化大黃素的代謝酶活性較高，而代謝酶與大黃素的親和力則較低。

肝微粒體體外溫孵育法應(yīng)用于藥物代謝物結(jié)構(gòu)推測和藥物代謝酶活性劑毒理學(xué)及藥動(dòng)學(xué)研究等方面均具有簡單、快速、高效的優(yōu)勢，在臨床藥動(dòng)學(xué)研究制訂合理的給藥方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。但肝微粒體體外溫孵育法不能完全反映藥物在體內(nèi)的代謝情況，因此要綜合體內(nèi)試驗(yàn)才能最終確證[8-9]。

2 肝細(xì)胞體外溫孵法

肝細(xì)胞體外溫孵法的原理和制備思路與肝微粒體體外溫孵法一致，即先利用體外分離技術(shù)得到離體肝細(xì)胞，然后再人工模擬體內(nèi)生理溫度和環(huán)境等條件下輔以氧化還原型輔酶進(jìn)行混合，再對(duì)藥物進(jìn)行孵育反應(yīng)。此法適用于蛋白及mRNA水平藥物代謝酶誘導(dǎo)和酶活性的研究及藥物代謝過程中藥物相互作用的評(píng)估[10]。

2.1 運(yùn)用肝細(xì)胞體外溫孵法進(jìn)行藥物體外代謝途徑研究

Vacek J等[11]利用原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞懸液溫孵法研究了槲皮素、蘆丁、異槲皮素和花旗松素的體外代謝，運(yùn)用高效液相色譜-電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析鑒定了其代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示，這4種黃酮類化合物體外肝代謝的主要產(chǎn)物為甲基黃酮醇和葡萄糖苷酸化產(chǎn)物。在孵育的24 h過程中花旗松素的平均生物轉(zhuǎn)化率最高，為52.45%，主要被轉(zhuǎn)化為硫酸結(jié)合物;槲皮素和花旗松素比蘆丁和異槲皮苷在原代肝細(xì)胞懸液中更容易發(fā)生代謝。原代培養(yǎng)的細(xì)胞具有充足的天然水平的酶系和輔助因子，能保持細(xì)胞的完整性，適用于藥物代謝的生物轉(zhuǎn)化和藥物體外代謝途徑等的研究。

2.2 運(yùn)用肝細(xì)胞體外溫孵法進(jìn)行藥物體外代謝清除研究

王新茹[12]利用體外代謝的方法制備了13C標(biāo)記的甲霜靈代謝物標(biāo)樣，對(duì)選擇性代謝的研究結(jié)果表明，在肝微粒體中，S-甲霜靈優(yōu)先降解，代謝物的生成也具有明顯的選擇性;在肝細(xì)胞中，R-甲霜靈的消除速度快于S-甲霜靈，代謝物生成的選擇性一致，都是S-甲霜靈的生成量多于R-甲霜靈。因此，肝細(xì)胞體外溫孵法在藥物開發(fā)早期的試驗(yàn)研究中具有試驗(yàn)周期短、效率高、操作簡單等優(yōu)勢，可廣泛用于藥物代謝生物標(biāo)志物的篩選[13]。

2.3 運(yùn)用肝細(xì)胞體外溫孵法進(jìn)行藥物代謝相互作用研究

吳雅麗等[14]采用人肝細(xì)胞溶質(zhì)體外孵育法，在孵育體系中加入底物法舒地爾和系列濃度的黃酮類化合物共同孵育，然后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定孵育液中法舒地爾的代謝物羥基法舒地爾的濃度。通過與對(duì)照組比較，確定各種黃酮類化合物對(duì)法舒地爾代謝的抑制程度，并采用GraphPad Prism 6.0軟件計(jì)算各化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果顯示，槲皮素、高良姜素、山柰酚、蘆丁、柚皮素、橙皮素、喬松素、表兒茶素、金合歡素及黃豆苷元對(duì)法舒地爾均有較強(qiáng)的代謝抑制作用，其IC50值均低于1μmol/L;蒙花苷、黃芩苷及燈盞花乙素對(duì)法舒地爾代謝的抑制作用較弱。臨床上使用法舒地爾時(shí)應(yīng)關(guān)注其與富含黃酮的中藥或食物間可能發(fā)生的代謝性相互作用。

2.4 運(yùn)用肝細(xì)胞體外溫孵法進(jìn)行肝細(xì)胞體外活性維持研究

為了解決肝細(xì)胞活性體外維持時(shí)間短的問題，減少新鮮肝組織的消耗，尤其在目前人肝細(xì)胞的應(yīng)用越來越普及的情況下，維持肝細(xì)胞的活性有積極意義。Aghdai MH等[15]通過對(duì)傳統(tǒng)的肝細(xì)胞冷凍技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，考察了二硫蘇糖醇和果糖對(duì)大鼠正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞HepG2在冷凍條件下活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孵化前通過加入二硫蘇糖醇和果糖進(jìn)行冷凍保存后，可增加大鼠正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞HepG2的生存能力和解凍功能。

肝細(xì)胞體外溫孵法與肝微粒體體外溫孵法整體研究思路幾乎相同，在代謝產(chǎn)物分析和藥動(dòng)學(xué)研究等方面有很多相似之處，但是細(xì)化到具體的代謝類型、代謝產(chǎn)物的種類及相應(yīng)的代謝酶等方面還是存在較多差異。目前藥物體外代謝模型仍以肝細(xì)胞體外溫孵法為主，隨著肝細(xì)胞冷凍技術(shù)的逐步發(fā)展，肝細(xì)胞體外活性試驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性也會(huì)不斷得到改善[16]。

3 肝灌流技術(shù)

肝灌流技術(shù)也稱體外全肝灌流，即先從機(jī)體分離得到完整的肝，然后通過人工灌注以維持肝細(xì)胞活性和生化功能，再對(duì)藥物進(jìn)行代謝作用。此法免受其他器官組織的作用干擾，可以定量研究試驗(yàn)藥物在肝的代謝情況，極大地發(fā)揮了離體系統(tǒng)試驗(yàn)的優(yōu)越性[17]。

Moghtadaee S等[18]運(yùn)用肝離體再灌流技術(shù)對(duì)具有選擇性酪氨酸激酶抑制作用的靶向抗癌藥伊馬替尼進(jìn)行大鼠體外研究。結(jié)果表明，伊馬替尼灌流質(zhì)量濃度為1、5μg/m L時(shí)，色譜條件下檢測出其在大鼠肝灌流液中主要代謝物為N-去甲基伊馬替尼，且與人和大鼠肝微粒體代謝試驗(yàn)結(jié)果一致。張如洪等[19]運(yùn)用肝灌流技術(shù)研究了異甜菊醇在大鼠肝內(nèi)的代謝情況，結(jié)果表明，異甜菊醇的藥動(dòng)學(xué)在體內(nèi)和體外的特征為其在肝中會(huì)發(fā)生葡萄糖酸化，肝是異甜菊醇消除的主要途徑，而其在腎的消除幾乎可以忽略。

肝灌流技術(shù)在定量研究藥物體外代謝行為和特點(diǎn)方面具有優(yōu)勢，對(duì)于藥物開發(fā)和毒理學(xué)研究具有不可或缺的重要意義。但該法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和數(shù)據(jù)處理技術(shù)要求很高，應(yīng)用范圍受限。

4 肝組織切片技術(shù)

1923年德國生物化學(xué)家瓦勃首次建立了手工肝組織切片技術(shù)，用微刀片所切取的肝組織厚度不一，此類肝切片中的細(xì)胞缺乏再生能力，容易缺氧死亡[20]。為了克服手工肝組織切片只適合短期試驗(yàn)研究的缺陷，20世紀(jì)80年初有人使用了組織切片機(jī)進(jìn)行切片，使肝組織切片在切割后達(dá)到了厚薄均勻的效果，對(duì)肝組織損傷比較小。隨后精確切取的肝組織切片技術(shù)被廣泛用于病理學(xué)、藥理學(xué)等研究中。

M cpherson S等[21]在超聲條件引導(dǎo)下運(yùn)用自動(dòng)化肝組織切片技術(shù)對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)感染的獼猴進(jìn)行肝組織活檢，證實(shí)了HCV能加劇肝纖維化和肝硬化的進(jìn)程。劉智文等[22]探討了腹腔鏡下膽道探查聯(lián)合術(shù)中快速冰凍切片肝活檢對(duì)膽道閉鎖的診斷價(jià)值，通過在腹腔鏡膽道探查術(shù)中剪取肝邊緣少量肝組織，送快速冰凍切片活檢，并將肝組織內(nèi)病理形態(tài)改變與術(shù)后石蠟切片進(jìn)行比較研究。結(jié)果顯示，術(shù)中肝組織冰凍切片與腹腔鏡探查、膽道造影及術(shù)后石蠟切片相對(duì)照符合率高，能準(zhǔn)確判斷肝纖維化以及小膽管增生程度，有助于膽道閉鎖的術(shù)中診斷及預(yù)后評(píng)估。

5 基因重組P450酶系

基因重組P450酶系即利用基因工程技術(shù)將調(diào)控人或動(dòng)物肝中的P450酶系所表達(dá)的基因整合到大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞中，通過細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)生高水平的P450酶系，并將其分離純化提取得到高效單一的P450同工酶[23]。

5.1 運(yùn)用基因重組P450酶系進(jìn)行誘導(dǎo)藥物代謝的P450亞型研究

SiD等[24]運(yùn)用基因重組P450酶系研究了細(xì)胞色素氧化酶P4502C9(CYP2C9)與黃酮及黃酮醇類化合物的相互作用。結(jié)果顯示，除黃酮外，黃酮醇類化合物對(duì)CYP2C9介導(dǎo)的4′-羥基雙氯芬酸代謝均有抑制作用，6-羥基黃酮是CYP2C9的非競爭性抑制劑，其余是競爭性抑制劑。因此，臨床使用黃酮醇類藥物時(shí)要避免與CYP2D6的抑制劑合用。魏春敏[25]運(yùn)用基因重組P450酶系考察了CYP1A2、CYP2A6、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1酶對(duì)去甲斑螯酸體外代謝的影響。結(jié)果表明，CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1酶是誘導(dǎo)去甲斑螯酸代謝的主要P450亞型酶，而其他5種亞型酶對(duì)此物質(zhì)代謝沒有明顯的誘導(dǎo)作用。

5.2 運(yùn)用基因重組P450酶系進(jìn)行藥物間相互作用研究

Haza AI等[26]運(yùn)用基因重組P450酶系技術(shù)，通過表達(dá)人CYP1A1和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A4的桿狀病毒細(xì)胞考察了楊梅黃酮和槲皮素對(duì)雜環(huán)胺誘導(dǎo)DNA氧化損傷的調(diào)節(jié)能力。結(jié)果顯示，這2種物質(zhì)發(fā)揮保護(hù)DNA氧化損傷的作用主要與其抑制CYP1A1酶活性有關(guān)。Jin SE等[27]運(yùn)用基因重組P450酶系方法評(píng)估了葛根湯、神速湯、小青龍湯、小柴胡湯、人參敗毒湯散、九味羌活湯等6種中藥配方在治療傳統(tǒng)感冒過程中對(duì)4種關(guān)鍵P450酶亞型的影響。結(jié)果表明，葛根湯能顯著抑制CYP2C19、CYP2D6和CYP2E1的活性;九味羌活湯對(duì)CYP2D6、CYP2E1活性的抑制作用要強(qiáng)于其他P450酶亞型;神速湯與小柴胡湯能改變CYP2C19、CYP2E1介導(dǎo)的藥物代謝;人參敗毒湯散與小青龍湯對(duì)CYP3A4、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1介導(dǎo)的藥物代謝沒有任何抑制作用?；蛑亟MP450酶系的運(yùn)用還可推廣到人體藥物氧化代謝多態(tài)性的預(yù)測評(píng)估中。

5.3 運(yùn)用基因重組P450酶系進(jìn)行藥物毒性機(jī)制研究

金桂芳等[28]運(yùn)用基因重組P450酶系研究了多氯聯(lián)苯(PCBs)代謝活化的主要人類CYP亞型，三氯聯(lián)苯、四氯聯(lián)苯遺傳毒作用的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，以及人硫酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(SULT1A1)是否參與PCBs的代謝減毒。結(jié)果顯示，除2個(gè)二英類PCBs(PCB 77、81)外，14個(gè)PCBs中 PCB4、5、16、17、18、20、22、28、52、60、66、74都對(duì)表達(dá)人CYP2E1與人SULT1A1的V79細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，均呈濃度依賴性和結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系，而SULT1A1抑制劑五氯酚并不影響或僅在一定程度上增強(qiáng)個(gè)別PCBs的作用。此研究結(jié)果提示人CYP2E1可能是特異代謝活化一系列非二英類PCBs為強(qiáng)作用誘變劑的主要生物轉(zhuǎn)化酶，而人SULT1A1對(duì)某些PCBs的活性代謝物則具有一定的解毒作用，這為以后研究藥物毒性分子作用機(jī)制方面提供了新的思路。

相對(duì)于其他幾種體外代謝研究方法，基因重組P450酶系在研究藥酶誘導(dǎo)特異性和選擇性方面具有分子水平的優(yōu)勢，可為藥物與酶結(jié)合位點(diǎn)的相互作用提供更多思路和信息，能解決藥物代謝微觀領(lǐng)域等細(xì)節(jié)問題，對(duì)新藥藥理作用機(jī)制的研究探索具有指導(dǎo)性意義[29]。但該法的試驗(yàn)成本較高，不利于生產(chǎn)應(yīng)用和推廣。

6 結(jié)語

體外肝代謝在離體條件下進(jìn)行，能直接觀察酶與底物代謝的作用結(jié)果，相對(duì)于體內(nèi)代謝在掌握藥物代謝途徑及代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定等方面具有突出的優(yōu)越性，在藥物先導(dǎo)化合物的篩選、新藥開發(fā)及藥物代謝酶活性研究等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景[30]。但是隨著對(duì)藥物代謝法研究的不斷深入，體外藥物肝代謝也存在一些問題:(1)藥物體外肝代謝研究作為一種體外代謝研究方法，不能全面反映體內(nèi)藥物的綜合代謝情況，與體內(nèi)代謝情況存在差異。今后需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等方法來完善藥物在體內(nèi)外的藥物代謝轉(zhuǎn)運(yùn)研究。(2)肝灌流技術(shù)和基因重組P450酶系等體外肝代謝研究方法目前對(duì)設(shè)備、試驗(yàn)操作成本、數(shù)據(jù)處理技術(shù)等要求較高，其運(yùn)用和推廣仍然受到一定的約束和限制。今后需建立簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、高效的科學(xué)技術(shù)方法和手段。

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R917;R969.1

A

1001-0408(2017)19-2703-05

2016-11-05

2017-05-09)

(編輯:余慶華)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31570349)

＊碩士研究生。研究方向:中藥及天然藥物活性成分。電話: 027-88041919。E-mail:2282968908@qq.com

#通信作者:教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向:中藥及天然藥物活性成分。電話:027-88041919。E-mail:benhongzh@whu.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.31