張佳泳，劉群峰，耿志杰，張 錦，張澤榮，劉春燕，林智健, 裴大婷

國(guó)家醫(yī)療保健器具工程技術(shù)研究中心，廣東省醫(yī)用電子儀器及高分子材料制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省醫(yī)療器械研究所，廣東 廣州 510500

氧氣釋放型PAMPSNa-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠性能的研究*

張佳泳，劉群峰，耿志杰，張 錦，張澤榮，劉春燕，林智健, 裴大婷

國(guó)家醫(yī)療保健器具工程技術(shù)研究中心，廣東省醫(yī)用電子儀器及高分子材料制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省醫(yī)療器械研究所，廣東 廣州 510500

通過(guò)化學(xué)交聯(lián)制備了聚(2-丙烯酰胺基-甲基丙磺酸鈉鹽)(PAMPSNa)水凝膠和PAMPSNa-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠，同時(shí)對(duì)其性能進(jìn)行了研究．試驗(yàn)結(jié)果表明：PAMPSNa水凝膠和PAMPSNa-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠均具有良好的溶脹性能，且純化的凝膠無(wú)細(xì)胞毒性；制備的水凝膠負(fù)載過(guò)氧化氫酶后與過(guò)氧化氫溶液反應(yīng)，體系能持續(xù)有效地釋放氧氣．

復(fù)合；水凝膠；氧氣；溶脹；生物相容性

水凝膠是一種能吸收大量水且具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)．水凝膠材料一般具有良好的生物安全性，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到重視，如用于隱形眼鏡、藥物載體及傷口護(hù)理等[1]．水凝膠材料用于處理傷口創(chuàng)面有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如保持創(chuàng)面濕潤(rùn)、吸收傷口滲液、降低燒傷溫度及不粘傷口等，目前水凝膠已成為一種重要的創(chuàng)面處理材料．

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)傷口敷料傳輸氧氣到傷處有利于傷口愈合，國(guó)外已經(jīng)有相關(guān)的研究開(kāi)發(fā)，如通過(guò)生化反應(yīng)釋放氧氣的Oxyzyme系列水凝膠傷口敷料、采用純化的血紅蛋白水溶液作為氧載體輸送氧分子的系統(tǒng)等[2-4]．國(guó)內(nèi)氧氣釋放敷料的研究尚不多見(jiàn)，本項(xiàng)目擬研究一類(lèi)能向傷口持續(xù)供送氧氣的水凝膠材料．首先采用新型的親水單體2-丙烯酰胺基-甲基丙磺酸(AMPS)聚合或與海藻酸鈉共聚合技術(shù)制備水凝膠，然后進(jìn)一步利用水凝膠負(fù)載過(guò)氧化氫酶，催化H2O2氧化還原并釋放出氧氣，該體系可作于調(diào)控傷口微環(huán)境、促進(jìn)傷口治愈．

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試劑及儀器

2-丙烯酰胺基-甲基丙磺酸(AMPS，純度大于98%)，上海瀚思化工有限公司生產(chǎn)；海藻酸鈉(食品級(jí))，天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；過(guò)硫酸銨(分析純)，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；四甲基乙二胺(TEMED，生化試劑)，上海展云化學(xué)有限公司生產(chǎn)；N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS，分析純)，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)；氫氧化鈉(分析純)，天津啟輪化學(xué)科技有限公司生產(chǎn)；二水硫酸鈣(分析純)，天津華盛天和化學(xué)有限公司生產(chǎn)；過(guò)氧化氫氧化酶(2000～5000 u/mg)，Biosharp生物科技公司生產(chǎn)．

SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司制造；YT-50恒溫水浴槽，深圳市宇泰品質(zhì)檢測(cè)設(shè)備有限公司制造；BC-J80S二氧化碳培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造；BDS200-PH倒置顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器責(zé)任有限公司制造．

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水凝膠體系的制備

聚2-丙烯酰胺-甲基丙磺酸鈉鹽(PAMPSNa)水凝膠的制備：在置于冰水浴的50 mL燒杯中加入1.2 g的氫氧化鈉，使其溶于17.8 mL的水中，然后加入6 g的AMPS和0.025 g的BIS及0.025g的過(guò)硫酸銨，配成均勻溶液后加入TEMED數(shù)滴，靜置成凝膠．在滴加TEMED前加入過(guò)氧化氫酶0.05 g，所獲得的凝膠即為負(fù)載酶的凝膠．

PAMPSNa-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠的制備：在A燒杯中加入0.5 g的海藻酸鈉，使其溶解于6.5 mL的水中；在置于冰浴中的B燒杯中加入1.2 g氫氧化鈉，使其溶于8.8 mL水中，然后加入6 g的AMPS，配成均勻溶液后將B燒杯的溶液加入A燒杯中，再加入0.025 g 的BIS和0.025 g的過(guò)硫酸銨，配成均勻溶液；在C燒杯中加入0.1 g的二水硫酸鈣，使其溶于1.9 mL水中，然后加入數(shù)滴TEMED，最后將C燒杯中混合物加入A燒杯中，冰浴中靜置成凝膠．

1.2.2 凝膠吸水性能的表征

將干燥的凝膠置于室溫水中，每隔一定時(shí)間取出樣品，用濾紙小心拭去凝膠表面的水并稱(chēng)重．時(shí)間t時(shí)的水凝膠的溶脹率Rt=(mt-m0)/m0，其中m0為t=0時(shí)凝膠的質(zhì)量，即干凝膠的質(zhì)量；mt為時(shí)間t時(shí)凝膠的質(zhì)量，即為t時(shí)凝膠中水的質(zhì)量．直至凝膠吸水后質(zhì)量不再增加，此時(shí)水凝膠達(dá)到溶脹平衡，其平衡溶脹率為Re．

1.2.3 水凝膠細(xì)胞毒性的測(cè)試

細(xì)胞毒性測(cè)試在廣東省質(zhì)量監(jiān)督醫(yī)療保健器具檢驗(yàn)站進(jìn)行．首先稱(chēng)取0.1 g樣品，然后加入6 mL的血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，其做為供試品．選取20%的苯酚溶液為陽(yáng)性對(duì)照；用10%的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡0.2 g/mL高密度聚乙烯24 h，所得浸提液為陰性對(duì)照．

細(xì)胞毒性測(cè)試：將傳代2次對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的3T3(L929)細(xì)胞加胰酶消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打均勻后顯微鏡下計(jì)數(shù)．根據(jù)細(xì)胞濃度，將培養(yǎng)液稀釋成250000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分別取10 mL加入到3個(gè)平皿中，然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h．經(jīng)24 h培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)近匯合，棄去原培養(yǎng)液，再在每個(gè)平皿中分別加入6 mL的溶化瓊脂與含10%血清的MEM培養(yǎng)基的混合液．待混合培養(yǎng)基凝固后在各皿中加入0.1%的中性紅染液5 mL，繼續(xù)避光培養(yǎng)20 min．將培養(yǎng)皿分組后分別加入供試品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待藥物作用24 h后，在皿底標(biāo)出試驗(yàn)樣輪廓，取下瓊脂表面試驗(yàn)樣，最后在顯微鏡下觀察拍照，記錄細(xì)胞毒性情況．

1.2.4 水凝膠氧氣釋放的測(cè)定

采用排水集氣法測(cè)水凝膠的氧氣釋放曲線．首先將含有酶的凝膠片放入到錐形瓶中，把5 mL的30%的H2O2與100 mL的蒸餾水混合，然后將其倒入錐形瓶中，迅速用帶有玻璃導(dǎo)管的橡膠塞塞緊.玻璃管用于導(dǎo)出產(chǎn)生的氣體，玻璃管的另外一端通向一個(gè)倒置水中且充滿水的量筒中，當(dāng)氣泡進(jìn)入量筒中時(shí)，量筒中的水被排出，從而得到釋放出來(lái)的氧氣體積．迅速塞緊橡膠塞的同時(shí)記下反應(yīng)時(shí)間． 反應(yīng)開(kāi)始后每隔2 min讀取量筒讀數(shù)一次，20 min后每隔5 min讀取一次，直到量筒讀數(shù)不再變化．

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠制備的影響因素

PAMPSNa水凝膠采用自由基共聚交聯(lián)的方法制備[5]，引發(fā)體系為過(guò)硫酸銨-TEMED．TEMED是一種有機(jī)胺，在室溫下能促進(jìn)自由基聚合反應(yīng)進(jìn)行；BIS作為交聯(lián)劑，其用量對(duì)水凝膠的交聯(lián)密度有較大地影響，用量較大時(shí)獲得的凝膠往往比較脆，本研究所用的BIS用量為0.1%～0.2%；AMPS單體含有磺酸基團(tuán)，具有較強(qiáng)的酸性，用氫氧化鈉中和后可得到中性的水凝膠，AMPS單體用量太少往往難以形成凝膠，本研究選用的AMPS用量為20%～30%．在PAMPSNa水凝膠制備過(guò)程中引入海藻酸鈉-鈣離子體系能形成雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的復(fù)合凝膠，PAMPSNa網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和海藻酸鈉網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)同時(shí)形成，成為互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)．圖1為凝膠樣品的外觀圖．從圖1可見(jiàn)，PAMPSNa水凝膠具有良好的透明性，復(fù)合凝膠為半透明．

圖1 凝膠外觀圖(a)PAMPSNa凝膠；(b)復(fù)合水凝膠Fig.1 Photo of the hydrogel(a) PAMPSNa gel；(b) composite gel

2.2 水凝膠吸水溶脹性能

將所制得的凝膠先制成切片，在室溫下晾干，然后再在真空45 ℃下干燥．通過(guò)稱(chēng)量不同時(shí)間下的干燥凝膠片的質(zhì)量，可知其吸水量，從而可測(cè)試水凝膠的吸水溶脹率．圖2為PAMPSNa水凝膠的吸水溶脹曲線．從圖2可見(jiàn)：PAMPSNa水凝膠達(dá)到吸水平衡時(shí)的溶脹倍率為415，表明有很強(qiáng)的吸水能力，這是由于PAMPSNa水凝膠含有磺酸鈉基團(tuán)，親水性較強(qiáng)；PAMPSNa-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠達(dá)到吸水平衡時(shí)的溶脹倍率為270，表明在凝膠中復(fù)合海藻酸鈉組分后凝膠的吸水性能下降，這是由于PAMPSNa-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠含有雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中一種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為PAMPSNa，另外一種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為海藻酸鈉．從圖2還可以看出，PAMPSNa-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠吸水速率比PAMPSNa水凝膠的略快，大約在10.5 h后復(fù)合水凝膠達(dá)到溶脹平衡，而PAMPSNa水凝膠需要13.5 h達(dá)到溶脹平衡．

圖2 凝膠溶脹曲線Fig.2 Gel swelling curve versus time

2.3 水凝膠的生物相容性評(píng)價(jià)

PAMPSNa水凝膠和復(fù)合水凝膠都是采用化學(xué)交聯(lián)法制備的，反應(yīng)后凝膠中殘留有單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑等小分子物質(zhì)，用去離子水反復(fù)浸泡以除去小分子物質(zhì)，從而獲得純凈的凝膠．對(duì)純化后的凝膠材料進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，細(xì)胞毒性試驗(yàn)形態(tài)如圖3所示．從圖3可見(jiàn)：陰性對(duì)照組的(圖3(a))細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)細(xì)胞溶解，細(xì)胞毒性計(jì)分為0，即無(wú)；陽(yáng)性對(duì)照組(圖3(b))的整個(gè)培養(yǎng)區(qū)細(xì)胞層幾乎完全破壞，細(xì)胞溶解，細(xì)胞毒性計(jì)分為3，即重度細(xì)胞毒性；PAMPSNa凝膠樣品(圖3(c))和復(fù)合凝膠(圖3(d))的細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)細(xì)胞溶解，細(xì)胞毒性計(jì)分均小于1，即無(wú)細(xì)胞毒性．由此可見(jiàn)，本研究合成的PAMPSNa和復(fù)合凝膠均具有良好的細(xì)胞相容性．

圖3 凝膠的細(xì)胞毒性測(cè)試(a)陰性對(duì)照；(b)陽(yáng)性對(duì)照；(c)PAMPSNa凝膠；(d)復(fù)合凝膠Fig.3 The cell toxicity test of hydrogel (a) negative control；(b) positive control；(c) PAMPSNa gel；(d) composite gel

2.4 水凝膠的氧氣釋放性能

通過(guò)負(fù)載過(guò)氧化氫氧化酶的水凝膠片與過(guò)氧化氫水溶液作用，能持續(xù)地釋放氧氣，其反應(yīng)機(jī)理見(jiàn)下式[6]．在反應(yīng)過(guò)程中，葡萄糖氧化酶主要起催化劑的作用．

圖4為負(fù)載過(guò)氧化氫氧化酶的水凝膠片浸泡在稀釋的過(guò)氧化氫水溶液中的氧氣釋放曲線．從圖4可見(jiàn)：當(dāng)酶負(fù)載于凝膠中時(shí)，初始時(shí)段有氧氣快速釋放，10 min后氧氣釋放量逐漸趨于平穩(wěn)；氧氣釋放持續(xù)時(shí)間90 min，釋放量達(dá)到490 mL(5 mL的30%的H2O2分解出氧氣的理論計(jì)算值為540 mL)．這表明，酶催化過(guò)氧化氫分解是比較高效的反應(yīng)，反應(yīng)速率快，通過(guò)水凝膠負(fù)載酶的方式釋放氧氣是持續(xù)有效的．

圖4 負(fù)載酶凝膠的氧氣釋放曲線Fig.4 The oxygen release curve of gel loading enzyme versus time

3 結(jié) 論

采用2-丙烯酰胺基-甲基丙磺酸鈉鹽與海藻酸鈉共價(jià)交聯(lián)能制備出復(fù)合的雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠，該凝膠具有良好的吸水溶脹性、吸水倍率高、無(wú)細(xì)胞毒性，具有生物安全性．采用該凝膠負(fù)載酶與過(guò)氧化氫結(jié)合能安全有效的緩釋放氧氣．具有釋氧功能的水凝膠材料可用于創(chuàng)面供氧，有利于促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)．

[1] 劉群峰，陳軍，耿志杰，等．聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基殼聚糖原位水凝膠的研究[J]．材料研究與應(yīng)用，2016，10(3)：209-211．

[2] 張澤榮，陳軍，耿志杰，等．局部氧療的研究進(jìn)展及其在慢性創(chuàng)面治療上的應(yīng)用[J]．材料研究與應(yīng)用，2016，10(2)：84-87．

[3] IVINS N，SIMMONDS W，TURNER A，et al．The use of an oxygenating hydrogel dressing in VLU[J]．Wounds UK，2007，3(1)：77-81．

[4] SCHOLANDER P F．Oxygen transport through hemoglobin solutions[J]．Science，1960，131(3400)：585-590．

[5] NALAMPANG K，PANJAKHA R，MOLLOY R．Structural effects in photopolymerized sodium AMPS hydrogels crosslinked with poly(ethylene glycol) diacrylate for use as burn dressings[J]．Ournal of Biomaterials Science Polymer Edition，2013，24(11)：1291-304．

[6] 張坤生，田薈琳．過(guò)氧化氫酶的功能及研究[J]．食品科技，2007，32(1)：8-11．

Study on the properties of oxygen release PAMPSNa-sodium alginate composite hydrogel

ZHANG Jiayong，LIU Qunfeng，GENG Zhijie，ZHANG Jin，ZHANG Zerong，LIU Chunyan，LIN Zhijian，PEI Dating

NationalEngineeringResearchCenterforHealthcareDevices，GuangdongKeyLabofMedicalElectronicInstrumentsandPolymerMaterialProducts，GuangdongInstituteofMedicalInstruments，Guangzhou510500，China

Poly(2-Acrylamide-2-methylpropanesulfonic acid sodium salt)(PAMPSNa)hydrogel and PAMPSNa-sodium alginate composite hydrogel were prepared by chemical crosslinking, and the properties were studied. The experimental results show that PAMPSNa hydrogel and PAMPSNa-alginate hydrogel had good swelling properties，and without cell cytotoxicity after purification for the gel．The hydrogel system loading with catalaseperoxidase can continuously and effectively release oxygen by reacting with the hydrogen peroxide solution．

composite；hydrogel；oxygen；swelling；bio-compatibility

2016-08-17

廣東省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2012B010200029)；廣州市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專(zhuān)項(xiàng)(201508020124)

張佳泳(1968-)，男，廣東潮州人，高級(jí)工程師，碩士．

劉群峰(1977-)，男，湖南邵陽(yáng)人，副教授，博士.

1673-9981(2016)04-246-05

TQ427.6

A