柴 華，張 浩，畢建威

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)· ·論著·

體外胃癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞模型建立和生物學(xué)特性初步研究

柴 華，張 浩，畢建威

目的 采用原代培養(yǎng)胃間質(zhì)成纖維細(xì)胞(human gastric mucosal fibroblasts,HGMF)，構(gòu)建體外胃癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞模型，研究其生物學(xué)特性。方法 將調(diào)整培養(yǎng)條件的胃癌細(xì)胞系MKN- 45的培養(yǎng)上清液加入HGMF中培養(yǎng)，使其發(fā)生轉(zhuǎn)化。MTT法檢測其細(xì)胞增殖，ELISA方法測定其肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、趨化因子9(chemokine ligand 9，CXCL9)、趨化因子5(chemokine ligand 5，CCL5)的表達(dá)變化，RT-PCR檢測其端粒酶活性，BSA法檢測蛋白合成能力。結(jié)果 胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液與HGMF共培養(yǎng)可使其發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化HGMF細(xì)胞增殖能力(0.860±0.055)較HGMF(0.639±0.074)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，端粒酶活性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，蛋白質(zhì)合成能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞與親代細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性和分裂活性，蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，能表達(dá)和分泌更多的與胃癌細(xì)胞生長相關(guān)的生長因子和趨化因子。

成纖維細(xì)胞；胃癌；轉(zhuǎn)化

胃癌來源于上皮組織，上皮細(xì)胞與間質(zhì)微環(huán)境相互作用，間質(zhì)細(xì)胞(絕大部分為成纖維細(xì)胞)顯示出活躍的生物學(xué)特性：如調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖信號新生血管生成，腫瘤發(fā)生與腫瘤細(xì)胞本身的惡性增殖和間質(zhì)之間的相互作用密不可分，腫瘤間質(zhì)在整個(gè)過程中發(fā)揮了主動的作用。成纖維細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)成分中主要的細(xì)胞，腫瘤組織結(jié)構(gòu)和功能的動態(tài)平衡有賴于該細(xì)胞維持[1]。微環(huán)境對細(xì)胞成瘤潛能有很大影響，惡性細(xì)胞如果生長于特定的微環(huán)境中可被誘導(dǎo)保持分化狀態(tài)[2-3]。以往研究認(rèn)為成纖維細(xì)胞能對來源于腫瘤細(xì)胞的信號改變作出應(yīng)答，這種作用是一個(gè)被動過程，而新近的報(bào)道表明腫瘤基質(zhì)細(xì)胞可首先發(fā)生遺傳改變，從而主動參與和發(fā)動腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程[4]。

胃癌細(xì)胞與其微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞關(guān)系密切，一方面胃癌細(xì)胞分泌的功能蛋白可影響周圍成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性，使其發(fā)生惡性改變；另一方面發(fā)生變化的成纖維細(xì)胞通過旁分泌的方式產(chǎn)生的蛋白也可作用于癌細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞生長和血管形成。兩者相互作用有級聯(lián)放大效應(yīng)，增加腫瘤的惡性程度，但是目前對于產(chǎn)生作用的蛋白種類以及作用機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)擬建立體外的胃癌成纖維細(xì)胞模型，為篩選差異蛋白提供細(xì)胞基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

原代培養(yǎng)取材由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院手術(shù)室提供，手術(shù)由長海醫(yī)院普外科實(shí)施，選取進(jìn)展期胃癌標(biāo)本。標(biāo)本取材通過長海醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。DMSO、RPMI-1640、0.25% EDTA-胰蛋白酶、膠原酶I購自美國Sigma公司；青、鏈霉素購自美國R&D公司；胎牛血清購自美國Genmed公司；胃癌MKN- 45細(xì)胞株由東方肝膽外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供；端粒酶活性檢測試劑盒購自碧云天生物；MTT、BCA試劑盒購自博光生物；ELISA檢測試劑盒購自博奧生物；Gentl MACS組織處理機(jī)購自美天妮公司。

1.2 研究方法

1.2.1 原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 酶消化法培養(yǎng)，取材距離癌組織>10 cm以上的正常胃黏膜組織。貼壁生長的細(xì)胞經(jīng)優(yōu)勢生長法純化，免疫組織化學(xué)鑒定[5]。

1.2.2 體外構(gòu)建成纖維細(xì)胞模型 采取共培養(yǎng)法。復(fù)蘇MKN- 45細(xì)胞株，調(diào)整培養(yǎng)液RPMI 1640的FCS濃度為10%，PH值為7.4，培養(yǎng)箱37℃、5%CO2，3 d后吸取上清液，過濾雜質(zhì)并調(diào)整培養(yǎng)液PH值和血清濃度，-20℃低溫保存。將采集的MKN-45的培養(yǎng)上清液加入細(xì)胞濃度為6×104/ml原代成纖維細(xì)胞中培養(yǎng)至20代，平均每2～3 d傳代1次。細(xì)胞濃度為6×104/ml的原代成纖維細(xì)胞同步培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞增殖生長情況 觀察采用MTT法，ELISA法檢測肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1)、趨化因子9(CXCL9)、趨化因子5(CCL5)表達(dá)變化，端粒酶活性檢測采用RT-PCR法，細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量檢測采用BSA法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、方差分析。數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲取轉(zhuǎn)化HGMF

消化法原代分離出人胃黏膜成纖維細(xì)胞，免疫組化染色結(jié)果為波形絲蛋白(+)，角蛋白(-)和結(jié)蛋白(-)。胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液與正常成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建體外胃癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞模型，得到轉(zhuǎn)化HGMF。

2.2 細(xì)胞增殖動力學(xué)測定

轉(zhuǎn)化HGMF增殖較HGMF明顯加快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：HGMF：胃間質(zhì)成纖維細(xì)胞圖1 MTT法測定2種細(xì)胞的OD值

2.3 HGMF和轉(zhuǎn)化HGMF中HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9的表達(dá)

轉(zhuǎn)化HGMF和HGMF培養(yǎng)上清液中HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9的表達(dá)值見表2。

表2 HGMF和轉(zhuǎn)化HGMF中HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9的表達(dá)(pg/L，x±s)

細(xì)胞測定次數(shù)HGFTGF-β1CCL5CXCL9轉(zhuǎn)化HGMF10426.02±87.83199.85±22.28480.32±121.86277.24±59.64HGMF 10101.37±21.17110.30±17.26267.56±54.36168.81±58.43P值0.00000.00000.00020.0008

注：HGMF：胃間質(zhì)成纖維細(xì)胞，HGF：肝細(xì)胞生長因子，TGF-β1：肝細(xì)胞生長因子-β1，CCL5：趨化因子5，CXCL9：趨化因子9

2.4 端粒酶活性測定

10次測定得到的光密度(OD)值見表3。轉(zhuǎn)化HGMF和HGMF分別為0.860±0.055和0.639±0.074，前者明顯增強(qiáng)(t=7.515，P=0.000)。陰性對照OD=0.015，陽性對照OD=1.29。見表3。

表3 2種細(xì)胞端粒酶活性測定的OD值

細(xì)胞測定次數(shù)12345678910轉(zhuǎn)化HGMF0.7850.8210.9430.8750.8030.8050.8940.8870.8550.932HGMF 0.6630.6460.5970.6870.5240.7080.5840.6860.7550.548

注：OD：光密度，HGMF：胃間質(zhì)成纖維細(xì)胞

2.5 細(xì)胞總蛋白測定

總蛋白檢測標(biāo)準(zhǔn)液一元線性方程為y=0.697 6x+0.013 5，各濃度與吸光度值相關(guān)值R2=0.988 7，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，吸光度符合標(biāo)準(zhǔn)曲線。在該條件下測得5×105個(gè)GCAF蛋白濃度明顯高于HGMF，分別為(0.442±0.075) g/L和(0.194±0.020) g/L(t=7.091，P=0.001)。

3 討論

成纖維細(xì)胞是主要的基質(zhì)細(xì)胞成分，也是產(chǎn)生基質(zhì)蛋白的重要場所，支持腫瘤的基質(zhì)形成與腫瘤生長關(guān)系密切。受腫瘤微環(huán)境影響，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)活化異常，改變了原有的調(diào)控狀態(tài)，可影響胃癌細(xì)胞的分裂和侵襲進(jìn)程?；诔衫w維細(xì)胞在胃癌形成和發(fā)展中的重要作用，有學(xué)者提出抗腫瘤基質(zhì)新的治療方向，即靶向成纖維細(xì)胞的策略[6]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞合并培養(yǎng)，觀察兩者表型變化情況，可模擬成纖維細(xì)胞活化進(jìn)程[7]。胃癌細(xì)胞系MKN-45是一種侵襲能力較強(qiáng)的胃癌細(xì)胞，能以實(shí)體瘤或腹水瘤形式生長，因其可分泌功能蛋白對成纖維細(xì)胞產(chǎn)生作用，促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。微生物學(xué)首先引入轉(zhuǎn)化概念，即依賴于新遺傳物質(zhì)攝入的變化，而培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是指自發(fā)性的或誘導(dǎo)引起的永久性表型改變。本實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)代數(shù)為20代，考慮到成纖維細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性，如果培養(yǎng)代數(shù)過少，則很難產(chǎn)生轉(zhuǎn)化效應(yīng)，而培養(yǎng)代數(shù)過長，即使沒有實(shí)驗(yàn)干預(yù)，連續(xù)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞也可能自發(fā)性發(fā)生轉(zhuǎn)化。

胃癌細(xì)胞MKN-45培養(yǎng)上清液和人胃粘膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)后，促使成纖維細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，在很多方面有異于人胃粘膜成纖維細(xì)胞的活化特征。端粒酶活性升高表明有更多細(xì)胞處于S期，因?yàn)榧?xì)胞在G1/G0期開始表達(dá)端粒酶，S期達(dá)高峰[8]。實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)化HGMF總蛋白量明顯增加，原因是轉(zhuǎn)化細(xì)胞以旁分泌方式分泌功能因子刺激腫瘤細(xì)胞生長[9]。成纖維細(xì)胞是體內(nèi)HGF和TGF-β1的主要合成場所。HGF受體c-Met表達(dá)于上皮細(xì)胞，其信號通路的失常可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長。TGF-β1具有廣泛的生物學(xué)作用，TGF-β1的高水平表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[10]。CXCL9和CCL5是目前已報(bào)道的與胃癌相關(guān)的趨化因子，不僅可自分泌系統(tǒng)直接刺激腫瘤細(xì)胞增殖，也可激活機(jī)體的特殊免疫應(yīng)答，調(diào)控腫瘤血管生成。趨化因子誘導(dǎo)靶細(xì)胞趨化性遷移，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，微環(huán)境中成纖維旁分泌是趨化因子/受體的一個(gè)重要來源[11-12]。結(jié)果表明以上與胃癌密切相關(guān)的生長因子和趨化因子在轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞上清液中表達(dá)上調(diào)，提示其生物學(xué)特性活躍。

以往研究正常成纖維細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞之間的差異需要原代培養(yǎng)出兩種細(xì)胞，難度較大。本實(shí)驗(yàn)用胃癌細(xì)胞MKN-45培養(yǎng)上清液和人胃黏膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)并促使后者發(fā)生轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選出差異蛋白提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(本文編輯：彭潤松)

Establishment of vitro cell model of human gastric mucosal fibroblasts and preliminary exploration of its biological features

Chai Hua, Zhang Hao, Bi Jianwei

(DepartmentofGeneralSurgery,ShanghaiJiangwanHospital，Shanghai200434,China)

Objective To establish vitro cell model of human gastric mucosal fibroblasts (HGMF) in gastric cancer and explore its biological features.MethodsHGMF were cultured with the regulated supernatant of MKN-45 cells, facilitating its transformation. Cell proliferation was detected by MTT assay. The expressions of hepatocyte growth factor(HGF), transforming growth factor beta 1(TGF-β1), chemokine ligand 5 (CCL5)and chemokine ligand 9(CXCL9)were detected by ELISA. The activity of telomerase and the ability to synthesize proteins were detected by RT-PCR and BSA assay respectively.ResultsSupernatant of MKN-45 could induce HGMF transformation. The ability of cell proliferation was enhanced (P<0.05), and the expression levels of HGF, TGF-β1, CCL5 and CXCL9 were also increased (P<0.01). Telomerase activity and the ability to synthesize proteins were also enhanced respectively (P<0.01).ConclusionDetection results suggested that the transformed HGMF seemed to display higher biological activity, as compared with that of the parent cells, with stronger proliferation activity and higher protein synthesis, and the HGMF could express and secrete more growth factor and chemokines associated with the growth of gastric cancer cells.

Fibroblast; Gastric cancer; Transformation

200434 上海，上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院普外科(柴華)；第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院普外科(張浩、畢建威)

畢建威，電子信箱：noflyzone@163.com

R735.2

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2016.06.004

2016-08-15)