（重慶市六九畜牧科技股份有限公司）

酶聯(lián)免疫吸附法在口蹄疫診斷中的研究進(jìn)展

張 亮

（重慶市六九畜牧科技股份有限公司）

口蹄疫屬于我國(guó)一類動(dòng)物疫病，防治該病的關(guān)鍵是做出及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷。本文介紹了ELISA方法在口蹄疫診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展，傳統(tǒng)ELISA方法包括液相阻斷ELISA、間接ELISA、固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接夾心ELISA；新型ELISA方法包括單克隆抗體ELISA、PCR-ELISA、生物素-親和素ELISA及Dot-ELISA。隨著技術(shù)的進(jìn)步及養(yǎng)殖領(lǐng)域的規(guī)模化，ELISA 在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查中將會(huì)有更加廣泛的應(yīng)用。

口蹄疫；診斷方法；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

口蹄疫（FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的偶蹄動(dòng)物共患的一種烈性傳染病。該病發(fā)病率極高，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)及國(guó)際貿(mào)易影響嚴(yán)重，因而備受重視。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的基本原理是將抗原或者抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，通過(guò)底物顯色后用肉眼或者分光光度計(jì)判定結(jié)果。作為一種新的免疫診斷技術(shù)，ELISA自20世紀(jì)70年代初問(wèn)世以來(lái)發(fā)展十分迅速，被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

1 傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)FMDV

1.1 液相阻斷ELISA

Hamblin等[1]于1986年以病毒中和試驗(yàn)（VNT）和液相ELISA實(shí)驗(yàn)原理建立了用于檢測(cè)FMD抗體的液相阻斷ELISA，并做了液相阻斷ELISA與VNT的比較試驗(yàn)，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)在0.8以上，屬高度相關(guān)。

液相ELISA與VNT比較，最大的優(yōu)點(diǎn)就是使用滅活的抗原，無(wú)需擔(dān)心散毒，也使FMD的診斷從實(shí)驗(yàn)室走向了普通養(yǎng)殖場(chǎng)。液相阻斷ELISA主要應(yīng)用于2個(gè)方面：1)檢測(cè)FMD病毒感染；2)檢測(cè)免疫抗體，評(píng)價(jià)FMD疫苗免疫效力，這也體現(xiàn)出疫苗免疫動(dòng)物后該動(dòng)物抵抗強(qiáng)毒的攻擊能力。不足的是該方法檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)一定的假陽(yáng)性。

1.2 間接ELISA

間接ELISA方法是以口蹄疫病毒蛋白為包被抗原，用來(lái)檢測(cè)動(dòng)物血清樣品中的抗體水平，可用于鑒別感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物。與其他ELISA的區(qū)別在于直接將病毒抗原包被于板上，簡(jiǎn)單易操作，且具有較高的敏感性。2003年朱彩珠等[2]利用非結(jié)構(gòu)蛋白建立了間接ELISA方法，用于區(qū)分FMDV感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物，試驗(yàn)結(jié)果證明，該ELISA方法的靈敏度比病毒感染相關(guān)抗原瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)高。2010年張潤(rùn)祥等[3]建立了?？谔阋呖贵w的檢測(cè)方法，重復(fù)性試驗(yàn)表明，批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于10%，檢測(cè)非免疫無(wú)口蹄疫國(guó)家的牛陰性血清的特異性為100%；檢測(cè)感染血清敏感性為97.3%；檢測(cè)O-AsiaⅠ二價(jià)苗免疫牛血清，與4種商品化試劑盒比較，其符合率分別為69.0%、95.0%、90.4%和86.8%，符合率較高，說(shuō)明這種ELISA有良好的應(yīng)用價(jià)值。

1.3 間接夾心ELISA

間接夾心ELISA用于檢測(cè)大分子抗原，它不僅不必標(biāo)記每種抗體，還可提高實(shí)驗(yàn)的敏感性。該方法與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)相比，前者的敏感性遠(yuǎn)大于后者，并且克服了補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)樣品定型率低的缺點(diǎn)。對(duì)于含毒量較高的樣品，如新鮮的水泡皮和細(xì)胞培養(yǎng)物可在2～4 h內(nèi)獲得結(jié)果，如使用預(yù)先在實(shí)驗(yàn)室包被的免疫反應(yīng)板及凍干劑，將更便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在國(guó)內(nèi)，2007年吳國(guó)華等[4]進(jìn)一步發(fā)展了間接夾心ELISA，建立了口蹄疫O，A，Asia I各血清型間接夾心ELISA方法，檢驗(yàn)證明該方法具有良好的特異性和敏感性，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)在10%以下，具有很好的重復(fù)性，并且該ELISA診斷方法可應(yīng)用于口蹄疫病毒的定型診斷。

間接夾心ELISA用滅活的沉降系數(shù)為146s的完整FMDV粒子制備抗血清或作抗原，既可在一般實(shí)驗(yàn)室操作，也可制成試劑盒用于農(nóng)場(chǎng)檢測(cè)。該法可根據(jù)檢測(cè)目的不同用雙抗夾心法及其變法進(jìn)行病毒抗原的檢測(cè)，也可用阻斷夾心法等測(cè)定血清中的病毒抗體。

1.4 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA

固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA法除具有液相阻斷ELISA的優(yōu)點(diǎn)外，還具備特異性更高、操作更為簡(jiǎn)便、結(jié)果更穩(wěn)定等特點(diǎn)。但固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA由于需要大量的洗滌過(guò)程，減緩了樣品的檢測(cè)速度，所以在疾病暴發(fā)期間不能對(duì)大量的樣品進(jìn)行快速的檢側(cè)。

2008年林密等[5]建立了O型FMDV固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法，并確立了O型FMDV固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法檢測(cè)O型FMD血清陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：抗體效價(jià)大于或等于1∶32時(shí)判為O型FMD抗體陽(yáng)性；1∶16至1∶32時(shí)判為O型FMD抗體可疑。

2 新型ELISA檢測(cè)FMDV

2.1 生物素－親和素ELISA

親和素和生物素結(jié)合特異性與親和力都很強(qiáng)，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)可大幅提高ELISA的敏感性。親和素-生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，也可用于終反應(yīng)放大，還可在固相載體上預(yù)先包被親和素，然后把抗原或抗體與生物素結(jié)合，通過(guò)生物素-親和素反應(yīng)使抗原或抗體吸附于固相載體，這種包被法不僅可增加吸附抗原或者抗體量，而且可以使其結(jié)合位點(diǎn)充分暴露。

1992年Sorensen等[6]建立了可檢測(cè)FMDV SAT1、SAT2和SAT3血清抗體的阻斷ELISA方法，在這個(gè)方法中使用了生物素－親和素系統(tǒng)。他們用此方法與世界參考實(shí)驗(yàn)室的液相ELISA方法進(jìn)行了比較，結(jié)果證實(shí)該方法具有高特異性和靈敏性，可作為抗體水平評(píng)估的一種精確可行的方法。

2.2 單克隆抗體ELISA

單克隆抗體（McAb）具有高度均質(zhì)性和高度特異性，是檢測(cè)抗原位點(diǎn)的最佳分子探針，而ELISA對(duì)結(jié)果判斷比較客觀，敏感性和特異性比較高，因此近年來(lái)很多學(xué)者試圖通過(guò)結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)來(lái)大幅提高ELISA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。他們建立的方法有直接用純化抗原包被酶標(biāo)板用于檢測(cè)待測(cè)血清，也有基于單克隆抗體的間接捕獲ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，均具有敏感性高、重復(fù)性好、結(jié)果判定準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

2009年Morioka等[7]以單克隆抗體建立了直接夾心ELISA（SMDELISA），這種ELISA能從臨床樣品（血漿和唾液）中檢出FMDV抗原，陰性檢出率很低。其結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果高度一致，并且這種夾心ELISA對(duì)于每一個(gè)稀釋度的血清型抗原檢測(cè)結(jié)果都顯示了比世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦使用的間接夾心ELISA方法具有更高的光吸收度，顯示出其有極高的敏感性。

很多實(shí)驗(yàn)室為提高感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物的區(qū)分率，開(kāi)發(fā)出了FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白和單克隆抗體相結(jié)合的ELISA。FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白2C[8]，3A[9]，3B[10]，3D[11]的單克隆抗體已經(jīng)被成功制備，李永亮等[10]用3B單克隆抗體建立了液相阻斷ELISA方法，該方法能特異、敏感地檢測(cè)到病毒培養(yǎng)液中的非結(jié)構(gòu)蛋白3B成分，并能進(jìn)行定量。相信在不久的將來(lái)，2C、3A、3D單克隆抗體也會(huì)應(yīng)用到口蹄疫的ELISA當(dāng)中。

2.3 RT-PCR ELISA

RT-PCR ELISA是將PCR技術(shù)與ELISA相結(jié)合的一種抗原檢測(cè)技術(shù)，又稱免疫PCR。該方法的特點(diǎn)是利用PCR反應(yīng)的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增效應(yīng)帶來(lái)極高的敏感性，同時(shí)又具有高特異性的抗原檢測(cè)系統(tǒng)。其原理是用生物素標(biāo)記寡核苷酸探針，用鏈霉親和素包裹微孔反應(yīng)板，封閉后加入生物素標(biāo)記的探針與之結(jié)合，樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增（在PCR緩沖液中加入一定比例的地高辛標(biāo)記的dUTP）后，擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記探針進(jìn)行液相雜交，然后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗地高辛抗體，加入底物顯色，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

Barlic-Maganja等[12]建立了一種RT-PCR ELISA用來(lái)檢測(cè)FMDV，RT-PCR在免疫檢測(cè)單孔雜交試驗(yàn)中放大產(chǎn)品。

RT-PCR ELISA具有高靈敏度、檢測(cè)結(jié)果可靠、可進(jìn)行半定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可用于病毒檢測(cè)、疾病診斷和目的基因的檢測(cè)。與抗原ELISA相比，RTPCR ELISA方法可以對(duì)體積小但數(shù)量巨大的口蹄疫病毒滅活材料進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 Dot-ELISA

Dot-ELISA的基本原理與常規(guī)ELISA一樣，即將抗原或抗體包被于纖維素膜上，經(jīng)膜的吸附和富集作用，通過(guò)與相應(yīng)酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原形成標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，再經(jīng)酶促反應(yīng)使底物變色，最后以纖維素膜上斑點(diǎn)的有無(wú)及色澤深淺來(lái)判定結(jié)果。由于濾膜載體具有對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附、吸收水分、濃縮聚集等作用，所以盡管包被用的抗原或抗體量少，但膜上中心點(diǎn)單位面積的抗原或抗體濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)ELISA，從而大大提高了敏感性。并且Dot-ELISA可以作為區(qū)分自然感染和疫苗免疫動(dòng)物的有效方法

利用生物素-親和素系統(tǒng)生物放大作用而建立的ABC-Dot-ELISA更進(jìn)一步提高了Dot-ELISA的敏感性。楊永欽等[13]研制出用于檢測(cè)FMDV的ABCDot-ELISA試驗(yàn)方法，用光敏素標(biāo)記的純化A蛋白(SPA)代替第二抗體，通過(guò)堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的親和素檢測(cè)生物素化抗體，最后加底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和四氯唑藍(lán)(NBT)顯色判定，該法具有良好的重復(fù)性和特異性，樣品用量少，不需特殊儀器、縮短檢測(cè)時(shí)間等特點(diǎn)。由于引入生物素系統(tǒng)和AP，使靈敏度大大提高，能檢出微量抗體，比常規(guī)ELISA更為敏感。

3 總結(jié)與展望

ELISA與其他免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比具有靈敏、特異、廉價(jià)、快速、穩(wěn)定且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)，因此不僅適用于大量臨床標(biāo)本的檢測(cè)，也適合血清流行病學(xué)調(diào)查，目前在國(guó)內(nèi)許多中型養(yǎng)殖場(chǎng)即配備，使用范圍廣。另外ELISA還有一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)：既可以用來(lái)檢測(cè)抗原，也可以用于檢測(cè)抗體。而在檢測(cè)抗體中避免了對(duì)活病毒的操作，非常適合在普通實(shí)驗(yàn)室使用。

現(xiàn)在研究人員正在不斷地優(yōu)化反應(yīng)條件，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，使ELISA更靈敏穩(wěn)定而又操作方便，有報(bào)道[14]一種同源分析的新型ELISA也許會(huì)應(yīng)用于診斷FMD的血清學(xué)試驗(yàn)中，這種新型ELISA不需要洗板，因此比傳統(tǒng)的ELISA方法更適合于機(jī)器操作，如果這種方法得到推廣，不僅節(jié)省人力、大大加快檢測(cè)速度，而且減少了人工操作產(chǎn)生的誤差。可以預(yù)見(jiàn)，ELISA檢測(cè)技術(shù)在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查中將會(huì)得到更為廣泛的應(yīng)用。

[1] HAMBLIN C, BARNETT I T.HEDGER R S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against footand-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA[J]. J Immunol Methods, 1986. 93(1)﹕115-21.

[2] 朱彩珠，張強(qiáng)，?；菔|，等.NSP-ELISA 鑒別FMDV 感染與免疫[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2003,33(8)﹕ 3-6.

[3] 張潤(rùn)祥，高明春，曲哲會(huì)，等.?？谔阋卟《綱P2 結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA 方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,32(2)﹕121-125.

[4] 吳國(guó)華，張強(qiáng)，顏新敏，等.口蹄疫定型ELISA 診斷方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37﹕ 603-604.

[5] 林密，馬軍武，祁淑蕓，等.O 型口蹄疫病毒固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,30(8)﹕ 627-630.

[6] SORENSEN K J, MADEKUROZWA R L.DAWE P. Foot-and-mouth disease﹕ detection of antibodies in cattle sera by blocking ELISA[J]. Vet Microbiol, 1992. 32(3-4)﹕253-65.

[7] MORIOKA K, FUKAI K, YOSHIDA K, et al. Foot-and-mouth disease virus antigen detection enzyme-linked immunosorbent assay using multiserotype-reactive monoclonal antibodies[J]. J Clin Microbiol,2009.47(11)﹕3663-8.

[8] 田美娜，李永亮，付元芳，等.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2c主要表位區(qū)的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31(1)﹕69-73.

[9] 劉丹丹，高明春，宋軍，等.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3AB單克隆抗體的制備及其對(duì)應(yīng)表位區(qū)分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33(9)﹕733-737.

[10] 李永亮，田美娜，盧曾軍，等.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3B單克隆抗體的制備與鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,25(2)﹕ 296-300.

[11] 田美娜，李永亮，盧曾軍，等.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3D單克隆抗體的制備及鑒定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2009,25(7)﹕ 625-627.

[12] BARLIC-MAGANJA D, GROM J, TOPLAK I, et al. Detection of foot and mouth disease virus by RT-PCR and microplate hydridization assay using inactivated viral antigens[J]. Vet Res Commun, 2004. 28(2)﹕149-58.

[13] 楊永欽，吳家驥.用生物素-親和素強(qiáng)化免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)口蹄疫病毒的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病,1994,77(4)﹕ 19-21.

[14] 閆海濱，趙剛，朱江巍，等.口蹄疫診斷技術(shù)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2010(4)﹕ 66-69.

2016-11-16）

張亮（1990-），男，重慶開(kāi)州人，碩士，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，主要從事藥物代謝酶基因檢測(cè)。