安芳蘭，劉學榮，董文教，武發(fā)菊，葛玉鳳，楊惠清，萬玉林，楊進才，張云德，殷宏

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州730046；2.蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州730046）

FMDV疫苗規(guī)?；a(chǎn)過程中生物反應器參數(shù)控制對病毒增殖的影響

安芳蘭1，劉學榮1，董文教1，武發(fā)菊1，葛玉鳳1，楊惠清1，萬玉林1，楊進才1，張云德1，殷宏2※

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州730046；2.蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州730046）

為探討生物反應器參數(shù)控制對規(guī)?；囵B(yǎng)過程中口蹄疫病毒增殖的影響，通過L9(34)正交試驗篩選溫度、DO值、pH值和攪拌轉速等參數(shù)對病毒繁殖的影響，確定最適過程控制參數(shù)并進行放大應用效果研究，為規(guī)?；a(chǎn)工藝的定型提供數(shù)據(jù)支持。結果表明：當溫度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6、DO值為50.0%～70.0%、攪拌轉速50～70 r/min，可有效提高口蹄疫病毒增殖能力，放大應用效果良好。

FMDV；生物反應器；參數(shù)控制；增殖；影響

口蹄疫（FMD）在我國的流行由來已久，給畜牧業(yè)發(fā)展造成巨大損失[1]，而在該病的防治現(xiàn)在全世界仍以常規(guī)疫苗為主，我國也是如此。在今后相當長一段時間內滅活疫苗仍然會占主導地位，而國際上口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)已采用先進的懸浮培養(yǎng)規(guī)?；a(chǎn)技術[2]，近年來隨著疫苗行業(yè)的不斷發(fā)展，人們對疫苗品質和產(chǎn)量要求的不斷提高，傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方式已經(jīng)跟不上社會的需求，因此疫苗規(guī)?；a(chǎn)技術應運而生，我國口蹄疫滅活疫苗也正在逐步步入規(guī)?；a(chǎn)模式。所謂病毒規(guī)模化培養(yǎng)技術（large-scale culture technology）是指利用計算機軟件控制各種影響病毒質量的參數(shù)如pH值、溫度、DO值和攪拌轉速（Agit）等，在生物反應器（bioreactor）中大量培養(yǎng)病毒用于疫苗生產(chǎn)的技術。

中國幼倉鼠腎細胞（Baby Hamster Kidney Cell，BHK-21）,是目前生產(chǎn)口蹄疫疫苗的最主要的工程細胞[3]，BHK-21是目前用來生產(chǎn)口蹄疫病毒的唯一細胞，其病毒生產(chǎn)過程中除了要滿足培養(yǎng)過程中必需的營養(yǎng)需求外，有必要建立合理的控制模型，因此進行pH值、DO值、溫度、Agit和接毒條件的優(yōu)化，使系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)，以滿足FMDV的最佳生長條件和較高的病毒滴度，從而為規(guī)?；a(chǎn)病毒的工藝確定提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 試驗細胞

BHK-21細胞，批號為BHK-21/W/S，由ETCC提供。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基MD611，由清大天一生產(chǎn)；培養(yǎng)基MEM1611-030，委托宜興賽爾公司加工。

1.3 新生犢牛血清

購自合格供應商，按照中農(nóng)威特生物科技股份有限公司新生犢牛血清內控質量標準檢驗合格后使用。

1.4 毒種

O/MYA98/BY/2010、O/PanAsia/TZ/2011、Re-A/ WH/09懸浮細胞毒，由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.5 主要設備

5L生物反應器，由美國NBS公司生產(chǎn)；500L生物反應器（中農(nóng)威特現(xiàn)有生物反應器）；細胞分析儀，由德國INNIVATIS公司生產(chǎn)；生物安全柜等。

1.6 小鼠及乳鼠

從蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心引進繁殖的昆明種小鼠，體重18～22g，乳鼠系2～3日齡小鼠。

2 方法

2.1 試驗設計

試驗采用L9(34)正交實驗設計，選取溫度（T）、pH值、DO值和Agit作為考察因素，分別命名為A、B、C、D 4個因素，以146S含量為評價指標，確定病毒培養(yǎng)過程中參數(shù)控制對病毒增殖的影響，從而進行差異顯著性分析，對3個最優(yōu)組病毒液TCID50、LD50進行檢測，試驗重復3次。水平及正交實驗方案見表1和表2。

2.2 病毒培養(yǎng)

將5L生物反應器中已培養(yǎng)好的對數(shù)生長期的細胞4℃～8℃靜置，待細胞沉降后棄掉上清，加入病毒維持液，終體積為500 mL，按病毒維持液體積的5%加入種毒，其生物反應器主要控制參數(shù)設定見表1，其他條件相同，生物反應器均自動控制，測定146S含量，對3個最優(yōu)組病毒液TCID50、LD50進行檢測，試驗重復3次。

2.3 培養(yǎng)工藝放大效果驗證

采用前期在5L生物反應器所獲得的生物反應器工藝，對3個毒種的病毒在500L生物反應器進行擴大培養(yǎng)，檢測病毒液TCID50、LD50和146S含量，試驗重復3次。

2.4 檢測方法

2.4.1 146S含量檢測按《口蹄疫滅活疫苗中間品及成品146S抗原含量檢測方法》進行檢測。

2.4.2 LD50和TCID50檢測按常規(guī)方法進行。

3 結果

3.1 過程參數(shù)控制對病毒效價的影響

按照預先確定的細胞密度及病毒的接種量接種后，對過程參數(shù)控制進行優(yōu)化，可實現(xiàn)生產(chǎn)工藝的最大優(yōu)化策略，具體設計如表1所示。

表1 因子水平表

表2 L9(34)正交試驗設計與結果分析

表2所示，8號試驗組146S含量最高，由此可見當溫度、Agit在3水平、pH值在2水平、DO在1水平時146S含量最高，可見該組合可有效提高146S含量，因此各因子的最佳水平組合為：A3B2C1D3，即溫度37.0℃，pH值7.6、DO為50.0%、攪拌為70 r/min時，極差分析表明：RA＞RB＞RC＞RD，從而確定溫度和pH值對病毒增殖的影響較大。

對較優(yōu)的三組進行差異顯著性分析，結果表明，第5組、第7組和第8組差異不顯著，然后對此三組進行病毒效價的檢測，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，結果如下圖1。

圖1 不同組別病毒滴度分析圖

由圖1可知，病毒效價TCID50和LD50均高于8.0，說明此三個組合均可用于病毒的大規(guī)模培養(yǎng)，因此病毒生產(chǎn)的參數(shù)宜控制如下：溫度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值50.0%～70.0%、攪拌轉速50～70r/min。

3.2 不同毒型的病毒工藝放大驗證

如表3所示，用該工藝生產(chǎn)O/MYA98/BY/2010株病毒，每0.2mL的病毒液病毒含量為107.50LD50～108.50LD50，每1.0mL的病毒液病毒含量為107.50TCID50～108.17TCID50，每1.0mL病毒液146S含量為1.95～2.85μg；O/PanAsia/TZ/2011株病毒，每0.2mL的病毒液病毒含量為107.50LD50～108.00LD50，每1.0mL的病毒液病毒含量107.50TCID50～107.83TCID50，每1.0mL病毒液146S含量為1.47～1.75μg；Re-A/WH/09株病毒，每0.2mL的病毒液病毒含量為107.00LD50～107.67LD50，每1.0mL的病毒液病毒含量107.50TCID50～107.83TCID50，每1.0mL病毒液146S含量為1.96～2.22μg?？梢?，采用5L生物反應器病毒培養(yǎng)參數(shù)進行500L病毒的培養(yǎng)，實現(xiàn)了生產(chǎn)工藝的直線放大，為規(guī)?；谔阋咭呙缟a(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持。

表3 不同毒種病毒含量及146S含量結果

4 結論

4.1 本研究采用L9（34）正交試驗設計，有效的篩選5L生物反應器生物反應器病毒增殖的最佳控制范圍：溫度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值50.0%～70.0%，攪拌轉速50～70r/min，是一種多、快、好、省的設計方法，進一步加快了試驗的進程，為病毒增殖條件的優(yōu)化提供新的思路與方法。

4.2 利用5L生物反應器所獲得的參數(shù)，進行三種病毒的500L規(guī)模的增殖驗證，效價和146S均符合疫苗規(guī)程要求。

4.3 可見通過該實驗獲得的病毒增殖控制參數(shù)，實現(xiàn)生產(chǎn)工藝的從5L到500L規(guī)模的直線放大，為規(guī)?；谔阋咭呙缟a(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持。但在口蹄疫疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝中，還有諸多因素會對口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)產(chǎn)生較大的影響，應將繼續(xù)開展相關試驗，研究和探索口蹄疫疫苗生產(chǎn)關鍵技術的連鎖效應，進一步提升我國規(guī)?；呙绲纳a(chǎn)技術。

[1]石慧,王仲兵,鄭明學，等．國內外口蹄疫的流行情況及防制[J]．畜禽業(yè),2009,（6）:48-51

[2]Telling R C.IndustralProduction of FMD Vaccine using Suspension Cell Some Comparative Results Relating“in vitro”Assay and Cattle Potency[R].Meeting of theResearch Group of the Standing Technical Committee of the European Commission for theContro lof Foot-and-Mouth isease,FAO,Rome,1975:95-100.

[3]Petiot E,Fournier F,Geny C,et al.Rapid screening of serum-free media for the growth of adherent Vero cells by using a small scale and non-vasive tool[J].Appl Biochem Biotechnol，2010,160（6）:1600-1615.

S852.65

A

1006-4907（2016）05-0048-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.05.020

2016-09-18

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201303046-05）。

安芳蘭（1979～），女，漢族，甘肅天水人，助理研究員，碩士，從事口蹄疫疫苗生產(chǎn)及工藝研發(fā)，359300818@qq.com。

※通訊作者：殷宏（1966～），男，漢族，甘肅隴西人，研究員，博士生導師，從事口蹄疫及寄生蟲學科研究，yinhong@caas.cn。