邱美珍，蔡文杰，楊俊，王慧，杜麗飛，李杰，周望平

（1.湖南鑫廣安農(nóng)牧股份有限公司，湖南長沙410100；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所,湖南長沙410131）

豬丹毒桿菌活疫苗的安全性試驗(yàn)

邱美珍1，2，蔡文杰2，楊俊2，王慧1，2，杜麗飛1，2，李杰1，周望平2

（1.湖南鑫廣安農(nóng)牧股份有限公司，湖南長沙410100；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所,湖南長沙410131）

為檢測豬丹毒桿菌疫苗的安全性，試驗(yàn)分為豬丹毒疫苗原液組（A1、A2)，豬丹毒疫苗分離組(B1、B2)，豬場豬丹毒分離組(C1、C2)，陽性參照組(D1、D2），陰性參照組E，共九組，每組菌液2個(gè)梯度，每個(gè)梯度菌液接種10只小鼠。同時(shí)疫苗還注射30～40日齡仔豬30頭，觀察小鼠、小豬生長、死亡、精神狀況、剖檢情況。結(jié)果顯示，與疫苗相關(guān)的菌株A、B、C組感染小鼠后，小鼠體重、生長、精神狀況、剖檢情況與陰性參照組相比，沒有顯著差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)束沒有死亡，而陽性參照組小鼠在感染24小時(shí)后，出現(xiàn)松毛，扎堆、不食、皮膚發(fā)紅、精神頹廢、于72小時(shí)內(nèi)全部死亡。疫苗注射小豬后，小豬精神狀態(tài)、生長與對(duì)照組相比沒有明顯差異。結(jié)果表明，本試驗(yàn)用豬丹毒桿菌疫苗批次對(duì)小鼠、小豬是安全的。

豬丹毒桿菌；疫苗；安全性試驗(yàn)

豬丹毒桿菌是一個(gè)古老的病原菌，可寄生于哺乳動(dòng)物、禽和魚類，還可感染人，豬丹毒桿菌感染豬將引起一種急性熱性傳染病，其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊(亞急性)、慢性疣狀心內(nèi)膜炎、皮膚壞死及多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎[1-2]。本病一年四季均可發(fā)生，炎熱多雨季節(jié)多發(fā)尤其是洪災(zāi)后。豬丹毒還是一種內(nèi)源性疾病，當(dāng)豬抵抗力下降、環(huán)境條件惡化、菌毒力增強(qiáng)常引起該病的爆發(fā)。目前，該病在世界上大多數(shù)國家都有分布，呈散發(fā)或流行性發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。最好的控制方式還是疫苗免疫，本實(shí)驗(yàn)旨在檢驗(yàn)疫苗的安全性，為豬場疫苗的注射提供安全性參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

營養(yǎng)肉湯自制、血瓊脂平板購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，昆明小鼠購自湖南斯萊克公司。

1.2 豬丹毒實(shí)驗(yàn)菌株

豬丹毒疫苗株（由某公司生產(chǎn)，編號(hào)1604002），疫苗分離菌株（從豬丹毒疫苗中分離細(xì)菌），疫苗注射后豬場分離菌株；豬丹毒陽性菌株：為某豬場病死豬分離細(xì)菌，由湖南省畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室分離保存。

1.3 細(xì)菌的分離純化[3]

采集疫苗注射5天后豬心血、病死豬的心血（某豬場）、通過純水稀釋疫苗（疫苗原液菌株）無菌接種于含5%血瓊脂平板，37℃倒置培養(yǎng)24 h后觀察菌落的生長。無菌挑取單個(gè)菌落進(jìn)行進(jìn)一步的純化，純化3次后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

1.4 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)總共分為豬丹毒疫苗原液組（A1、A2)，豬丹毒疫苗分離組(B1、B2)，豬場豬丹毒分離組(C1、C2)，陽性參照組(D1、D2），陰性參照組E，共9組，每組10只小鼠，每種菌液10倍稀釋成2個(gè)梯度，每個(gè)梯度菌液接種10只小鼠。

具體操作如下：將豬丹毒疫苗凍干粉根據(jù)說明書稀釋成2頭份/mL（1.82×109CFU/mL）、0.2頭份/mL（1.82×108CFU/mL）。將分離純化的菌株（或菌苗）接種到含5%犢牛血清的營養(yǎng)肉湯中，37℃搖床培養(yǎng)24h。取菌液用營養(yǎng)肉湯10倍稀釋，進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。然后，將計(jì)數(shù)稀釋后的1mL菌液（1.82× 109CFU/mL或者1.82×108CFU/mL）腹腔注射感染小鼠，對(duì)照組僅腹腔注射營養(yǎng)肉湯1mL。連續(xù)觀察7d，記錄各組小鼠的死亡情況。另外，剖檢觀察小鼠的心、肝、脾、肺、腎和淋巴結(jié)。同時(shí)，該批次疫苗注射30～40日齡小豬30頭，觀察7d，記錄小豬飲食、生長和精神狀況。小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組及注射菌量、體積見表1。

表1 豬丹毒安全性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

記錄和統(tǒng)計(jì)各組小鼠及小豬的精神、生長、死亡情況和解剖病變。

2 結(jié)果

2.1 小鼠精神、生長、死亡情況、解剖病變

小鼠接種細(xì)菌后，每天觀察小鼠精神狀況、死亡情況、于實(shí)驗(yàn)后7天稱重、剖檢小鼠觀察病變。結(jié)果表明與疫苗相關(guān)的菌株A、B、C組感染小鼠后，小鼠體重、生長、精神狀況、剖檢情況與陰性參照組相比，沒有顯著差異，體重都有所增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束沒有死亡，而陽性參照組小鼠在感染24小時(shí)后，出現(xiàn)松毛，扎堆、不食、皮膚發(fā)紅、精神頹廢、于72小時(shí)內(nèi)全部死亡。死亡小鼠剖檢病變主要有心耳出血，肺部有局部彌漫性出血，肝臟壞死灶，脾臟梗死等。結(jié)果見表2。

表2 豬丹毒安全性實(shí)驗(yàn)小鼠體重、死亡情況

2.2 小豬精神、生長、死亡情況

疫苗注射小豬后，小豬精神狀態(tài)、生長與對(duì)照組相比沒有明顯差異。在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，沒有死亡豬只。

3 討論

近幾年豬病的復(fù)雜多元化，“高熱病”經(jīng)常肆虐，豬場重點(diǎn)放在了幾種主要豬病的免疫(如豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍(lán)耳病等)，另外，由于豬丹毒病的抗生素治療效果好，從而忽略了豬丹毒的防疫。近期，全國很多縣市出現(xiàn)洪災(zāi)，造成豬群抵抗力下降，豬丹毒作為一種內(nèi)源性的細(xì)菌在全國各地均有零星發(fā)生的報(bào)道，有小范圍流行的可能性[4-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在為豬丹毒疫苗防疫提供安全性檢測。結(jié)果表明豬丹毒疫苗對(duì)小鼠和仔豬都是安全的，值得注意的是豬丹毒免疫必須在豬只健康的基礎(chǔ)上方可進(jìn)行，避開重胎期。豬只亞健康和重胎等非常狀態(tài)下活疫苗免疫可能應(yīng)激會(huì)大，造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失，非常狀態(tài)下的豬丹毒免疫安全性還有待進(jìn)一步探討。豬丹毒病的出現(xiàn)勢必會(huì)加重抗生素的使用，造成很多耐藥菌株的出現(xiàn)。之前的藥敏試驗(yàn)表明，臨床分離的豬丹毒桿菌能耐多種抗生素，如慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、林克霉素、和多黏菌素B等，給豬丹毒病的臨床預(yù)防和治療帶來了很大的困擾[6]。所以，但愿豬丹毒疫苗預(yù)防能提上豬病防控的議程。

[1]車勇良,陳如敬,王隆柏.豬丹毒桿菌的分離鑒定及其SpaA基因的遺傳變異分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(1):1591-1594.

[2]Hassanein R,Sawada T,Kataoka Y,et a1.Pathogenicity for mice and swine of Erysipelothrix isolates from the tonsils of healthy cattle[J].Vet Microbiol,2003,91(23):231-238.

[3]薛濤,顧叢叢,高崧,等.江蘇某奶牛場健康奶牛體內(nèi)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的分離鑒定及其對(duì)小鼠致病性的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011,42(6):830-837.

[4]薛輝,秦樹英,於慶雄,等．廣西豬丹毒桿菌分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].養(yǎng)豬,2014(6):97-100.

[5]王千菊,陳堅(jiān),巫月生,等.一株豬丹毒桿菌的分離鑒定及其對(duì)活疫苗免疫豬的攻毒試驗(yàn)[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2014,39(2):29-33．

[6]邱美珍,杜麗飛,楊愛梅,等.豬丹毒桿菌臨床分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].養(yǎng)豬,2011,119(6):111-112.

S852.65

A

1006-4907（2016）05-0039-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.05.016

2016-07-15