羅占華，劉秋

（1.湖南省常德市鼎城區(qū)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415000；2.湖南省常德市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415000）

市縣級獸醫(yī)實驗室布魯氏菌病診斷方法的比較

羅占華1，劉秋2

（1.湖南省常德市鼎城區(qū)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415000；2.湖南省常德市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南常德415000）

布魯氏菌病，是由布魯氏菌引起的人畜共患病，屬于二類動物疫病，對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展具有很大危害。針對市縣級獸醫(yī)實驗室常用的虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗與世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦使用的ELISA試驗進行比較，文章分析三者在市縣級獸醫(yī)實驗室的診斷意義。結(jié)果顯示，CELISA在敏感性和特異性均優(yōu)于試管凝集試驗、虎紅平板凝集試驗。筆者認(rèn)為虎紅平板凝集試驗適合大量樣本的初篩，ELISA比試管凝集試驗更適合在我國市縣級獸醫(yī)實驗室布魯氏菌病大量樣本監(jiān)測、診斷中推廣應(yīng)用。

布魯氏菌?。辉\斷方法；市縣級獸醫(yī)實驗室

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布?。?，是由布魯氏菌侵入機體而引起的人畜共患性全身傳染病。布病的主要臨床癥狀為雌性動物的流產(chǎn)、繁殖能力下降；雄性動物的睪丸炎和附睪炎。人常表現(xiàn)為持續(xù)性感染、間歇性流感樣的癥狀，其臨床特點為長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等，嚴(yán)重者失去勞動力[1]。國內(nèi)市縣級獸醫(yī)實驗室主要采用虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗等傳統(tǒng)布病抗體檢測技術(shù)。施自更等研究表明，虎紅平板凝集試驗與試管凝集試驗都會出現(xiàn)一定的假陽性及假陰性。由于試管凝集試驗的檢測結(jié)果不理想，OIE于2000年宣布不主張將其用于國際貿(mào)易[2]。市縣級獸醫(yī)實驗室是監(jiān)測布魯氏菌病的主體，為了市縣級獸醫(yī)實驗室獲得最適合的診斷布魯氏菌病的方法，作者對三種方法進行了認(rèn)真的比較。

1 材料

1.1 試劑

布病試管凝集試驗抗原，由青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心生產(chǎn)；布魯氏桿菌競爭酶聯(lián)法抗體診斷試劑盒，由瑞典Svanova公司生產(chǎn)；虎紅平板凝集試驗抗原、陰性血清、陽性血清，由蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。

1.2 血清

陰性血清2份，陽性血清10份(每份陽性血清倍比稀釋,稀釋倍數(shù)分別為1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍)。

1.3 儀器

酶標(biāo)儀（型號：mk3），由美國Thermo公司生產(chǎn)。

2 試驗設(shè)計

通過虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、CELISA方法進行檢測不同濃度的陽性血清、陰性血清，比較三種方法結(jié)果的準(zhǔn)確性，達到為市縣級獸醫(yī)實驗室篩選出適合的布魯氏菌病診斷方法。

2.1 布魯氏菌病試管凝集試驗（SAT）

2.1.1 試管凝集抗原在使用前用生理鹽水10倍稀釋。

2.1.2 將待檢血清做1:12.5、1:25、1:50、1:100稀釋。具體方法是：第一個管先加入2.3 mL石碳酸生理鹽水，以后每管都加入0.5 mL石碳酸生理鹽水，向第一個試管加入0.2 mL血清混勻后取0.5 mL加到第二個試管中作1:1稀釋。以后各管類推。第一個試管應(yīng)棄去1.5 mL稀釋血清。

2.1.3 將稀釋10倍的布魯氏菌菌液0.5 mL分別加入各個血清試管內(nèi)，搖勻，放37℃24 h觀察結(jié)果。最后血清的稀釋度為1:25、1:50、1:100、1:200。

2.1.4 比濁管設(shè)定：比濁管編號及設(shè)定見表1。

表1 SAT比濁管對照

2.1.5 結(jié)果判定：每次試驗均應(yīng)設(shè)陽性血清、陰性血清和抗原對照，在對照成立的前提下判定結(jié)果。待檢羊血清效價在1:50（++）以上者為陽性；1:25（++）為可疑，以下為陰性。

2.2 瑞典Svanova-C ELISA

2.2.1 將試劑盒恢復(fù)到室溫。

2.2.2 加入10倍稀釋的待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)對照血清，50 μL/孔。

2.2.3 在對照和檢測樣品的所有孔內(nèi)加入單抗溶液，50 μL/孔，室溫孵育30 min。

2.2.4 用PBST清洗4次。

2.2.5 每孔加入100μL交聯(lián)物溶液，室溫孵育30min。

2.2.6 用PBST清洗4次。

2.2.7 每孔加入100 μL TMB底物溶液，室溫條件下孵育10 min。

2.2.8 加入終止液50 μL/孔，終止反應(yīng)。

2.2.9 450 nm讀取OD值。

公式計算抑制率（PI）：抑制率（%）=100－OD樣品／ODcc×100%。

結(jié)果判定：PI≥30%判定為陽性，PI＜30%判定為陰性。

2.3 虎紅平板凝集試驗（RBPT）：

取0.03mL待檢血清，滴于潔凈的玻璃板上，然后取等體積虎紅平板凝集抗原與血清充分混勻，室溫作用。結(jié)果判定：在4min內(nèi)判定結(jié)果。任何程度的凝集均為實驗陽性，完全不凝集為陰性，同時做陰陽性對照。

3 結(jié)果

通過三種診斷方法的結(jié)果比較得出，虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、CELISA與真實值的符合率分別為88.9%、81.9%、95.8%（詳見表2）。

表2 各血清組檢測結(jié)果比較

4 結(jié)論

我國市縣級獸醫(yī)實驗室儀器設(shè)備簡單，從業(yè)人員素質(zhì)較低等因素決定我們市縣級獸醫(yī)實驗室實用的布魯氏菌病診斷方法必須結(jié)果準(zhǔn)確、易于操作。王秀麗等的研究表明IELISA方法靈敏度比SAT、PRBT高60～150倍[3]，與本試驗的結(jié)果一致。結(jié)合國內(nèi)外專家學(xué)者的研究成果，筆者認(rèn)為虎紅平板凝集試驗適合大量樣本的初篩，ELISA適合在我國市縣級獸醫(yī)實驗室布魯氏菌病大量樣本監(jiān)測、診斷中推廣應(yīng)用，而試管凝集試驗應(yīng)該與國際接軌，不主張其作為該病確診的方法。

[1]聞玉梅.現(xiàn)代微生物學(xué)[M].上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:455-469.

[2]施自更,顧祥國,江欲吉.奶牛兩病檢測操作的改進與創(chuàng)新措施[J].浙江畜牧獸醫(yī),2012,(4):15-16.

[3]王秀麗,蔣玉文,毛開榮,等.布魯氏菌病實驗室診斷方法的研究進展[J].中國獸藥雜志,2011,(11):37-42.

S855.12；S854.43

B

1006-4907（2016）05-0046-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.05.019

2016-09-22

羅占華（1971～），女，漢族，大專，助理獸醫(yī)師，主要從事動物疫病監(jiān)測，cdsxmk@163.com。