張志明,高鵬華,胡遼遼，馬 瑩*

(1.西安市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安710003；2.西北大學(xué) 體育部，陜西 西安710069；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安710061)

TaqMan-MGB法檢測ACTN3基因 R577X多態(tài)性

張志明1,高鵬華2,胡遼遼3，馬 瑩1*

(1.西安市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安710003；2.西北大學(xué) 體育部，陜西 西安710069；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安710061)

目的 研制檢測ACTN3 基因R577X多態(tài)性的TaqMan-MGB探針方法。方法 根據(jù)美國國立醫(yī)學(xué)圖書館網(wǎng)站公布的人類ACTN3基因序列(rs1815739)，設(shè)計(jì)檢測ACTN3基因R577X多態(tài)性的特異引物和TaqMan-MGB探針,建立和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。 結(jié)果 對(duì)98例西北大學(xué)漢族學(xué)生進(jìn)行ACTN3 基因R577X多態(tài)性檢測,并對(duì)上述所有檢測標(biāo)本再進(jìn)行堿基序列測序，兩種檢測方法的檢測結(jié)果經(jīng) Kappa分析，Kappa=0.99。 結(jié)論 兩種檢測方法結(jié)果一致性較好，建立了檢測ACTN3基因 R577X多態(tài)性的TaqMan-MGB法。

實(shí)時(shí)熒光定量；ACTN3；基因多態(tài)性

(ChinJLabDiagn,2017,21:0831)

人類ACTN3基因位于11號(hào)染色體，由于其外顯子1747位堿基存在C-T堿基多態(tài)性，使得原編碼的第577位精氨酸(CGA)密碼子變成了終止密碼子(TGA)而編碼任何蛋白,于是導(dǎo)致了ACTN3蛋白的缺失，其原基本功能可由其家族中其它蛋白來補(bǔ)償，因而也不會(huì)發(fā)生肌肉疾病，即為ACTN3 基因R577X多態(tài)性(或C1747T多態(tài)性，rs1815739)[1,2]。近年來ACTN3基因 R577X多態(tài)性是否與運(yùn)動(dòng)員素質(zhì)(速度、爆發(fā)力以及耐力)之間存在關(guān)聯(lián)性已成為近年來眾多國內(nèi)外運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究者的研究熱點(diǎn)[3,4]，于是如何建立快速、準(zhǔn)確的ACTN3基因 R577X多態(tài)性的檢測方法就成為研究者們首要的課題，實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-MGB是檢測基因多態(tài)性的一種成熟可靠的方法，本研究的目的就是通過建立和優(yōu)化ACTN3基因 R577X實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-MGB檢測體系，為ACTN3基因 R577X多態(tài)性研究提供可靠的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器設(shè)備：DYY-2C型電泳儀(北京六一儀器廠)、美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)生產(chǎn)的ABI 7300 PCR擴(kuò)增儀及ABI3130 型DNA測序儀。主要試劑:瓊脂糖(BBI公司)、PCR Premix試劑、Loading Buffer(寶生物工程大連有限公司)、DNA提取液(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)、美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司TaqMan Universal PCR Master Mix(貨號(hào)：4304437)。

1.2 基因組總DNA提取

采集檢測者外周靜脈血3 ml于無任何添加劑的普通干燥管中，3 000 r/min離心10 min，分離血清,采用煮沸法提取人類基因組總DNA，200 μl DNA提取液中加入200 μl血清充分振蕩混勻，100℃金屬浴中煮沸10 min后，12 000 r/min 離心10 min取其上清液，-20℃冷凍保存。

1.3 TaqMan-MGB法檢測ACTN3基因 R577X

1.3.1 PCR 引物設(shè)計(jì)與合成

針對(duì)ACTN3基因 R577X多態(tài)性位點(diǎn)(Genebank：rs1815739)，設(shè)計(jì)并不斷甄別上下游特異引物，上游引物為5′-GCGCTAGAGCGGAGGAGAAG-3′，下游引物為5′-GCGGCCCTGCTCCACCAATC -3′，R 等位基因探針:FAM-GAGGCTGACTGAGAG,X等位基因探針:VIC-GAGGCTGACCGAGAG，上述檢測探針和引物均有上海生物工程有限公司合成。

1.3.2 基因多態(tài)性檢測及分型結(jié)果判定

使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行多態(tài)性檢測，PCR反應(yīng)體系如下：研究對(duì)象模板DNA 5 μl,TaqMan通用反應(yīng)試劑30 μl，上、下游引物及檢測探針各0.5 μl，最后用雙蒸水補(bǔ)足總反應(yīng)體積為50 μl，反應(yīng)條件分別為先94℃ 變性8分鐘后 92℃ 20秒和55℃50秒共40個(gè)循環(huán)，熒光檢測期為55℃50秒，如果檢測結(jié)果為單一FAM黑色報(bào)告曲線即為RR基因型或?yàn)閱我籚IC綠色報(bào)告曲線則為XX型，如果黑色和綠色兩個(gè)曲線均出現(xiàn)則為雜合子RX。

1.4 基因序列測序進(jìn)行ACTN3基因 R577X

[5]設(shè)計(jì)上下游引物序列分別為:上游引物5′-CTGTTGCCTGTGGTAAGTGGG-3′下游引物5′-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3′。擴(kuò)增后片段包括577位密碼子目標(biāo)基因，產(chǎn)物長度為290 bp，反應(yīng)總體積為50 μl：模板DNA4 μl，上下游引物各0.5 μl，PCR反應(yīng)通用體系45 μl,反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 2 min，變性 95℃ 40 s，退火55℃ 30 s，延伸 72℃ 40 s共40個(gè)循環(huán)后，最后72 ℃ 延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物再經(jīng)電泳提純后送上海生物工程有限公司在全自動(dòng)ABI3130 型DNA測序儀上進(jìn)行產(chǎn)物測序檢測。

1.5 TaqMan-MGB法和基因序列測序一致性評(píng)價(jià)

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件Kappa分析進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 TaqMan-MGB法檢測ACTN3基因 R577X結(jié)果

共檢測98例西北大學(xué)漢族學(xué)生，平均年齡為21±3.9歲，其中男43例，女55例。檢測結(jié)果為RR基因型32例，占(32.65%，32/98),RX基因型48例，占(48.98%，48/98),RR基因型18例，占(18.37%，18/98)。

2.2 基因序列測序進(jìn)行ACTN3基因 R577X結(jié)果

上述98例檢測標(biāo)本重新經(jīng)測序引物擴(kuò)增、電泳提純后外送測序，除1例測序失敗外，其他97例均測序成功并與TaqMan-MGB法檢測ACTN3基因 R577X結(jié)果吻合。

2.3 Kappa分析

TaqMan-MGB法與基因序列測序檢測結(jié)果經(jīng) Kappa分析，Kappa=0.99，表明這兩種檢測方法結(jié)果一致性較好。

3 討論

存在于人類骨骼肌中的α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)是肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白，其家族中有輔肌動(dòng)蛋白-1、2、3和4共 4種存在形式，與運(yùn)動(dòng)員杰出能力表現(xiàn)有關(guān)的主要為ACTN 3基因，尤其該基因577位點(diǎn)的多態(tài)性[6]，從2003年澳大利亞學(xué)者Yang等[7]發(fā)現(xiàn)ACTN3基因 R577X多態(tài)性與杰出運(yùn)動(dòng)員的能力表現(xiàn)有一定的關(guān)聯(lián)性后，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)該基因位點(diǎn)的多態(tài)性與杰出運(yùn)動(dòng)員的能力表現(xiàn)進(jìn)行了許多關(guān)聯(lián)性研究，以色列學(xué)者Ben-Zaken等[8]對(duì)137例跑步運(yùn)動(dòng)員和91例游泳運(yùn)動(dòng)員以及217例對(duì)照組研究表明，在無論長跑還是短跑運(yùn)動(dòng)員與對(duì)照組間基因型比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且短距離游泳運(yùn)動(dòng)員與短跑運(yùn)動(dòng)員比較RR基因型和R等位基因顯著增高，日本學(xué)者Kikuchi等[9]對(duì)1057例日本田徑運(yùn)動(dòng)員，其中627例為力量型運(yùn)動(dòng)員，430例為耐力型運(yùn)動(dòng)員，對(duì)照組810例進(jìn)行了大樣本隊(duì)列研究，研究結(jié)果也證實(shí)了杰出運(yùn)動(dòng)員的能力表現(xiàn)與ACTN3基因 R577X多態(tài)性有關(guān)，為此ACTN3基因R577X多態(tài)性作為杰出運(yùn)動(dòng)員能力的預(yù)測和基因選材越來越受到體育科研人員的關(guān)注。

目前，隨著分子運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，研究基因多態(tài)性的方法也較多，但各許多方法由于其自身方法學(xué)特點(diǎn)存在著各自的優(yōu)缺點(diǎn)，比如目前多數(shù)研究常采用的PCR-限制性片段長度多態(tài)性、等位基因特異性-PCR,由于均需先PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后才能區(qū)分基因型，雖然此類方法操作簡單，實(shí)驗(yàn)成本較低，一般實(shí)驗(yàn)室容易開展，但其靈敏度低，整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，比較容易受其他標(biāo)本污染，容易造成假陽性及假陰性。基因堿基序列測序是目前最為準(zhǔn)確、可靠的基因多態(tài)性分型方法，但它需DNA 測序儀等昂貴儀器，并且對(duì)測序標(biāo)本有一定的嚴(yán)格要求，本研究中一例標(biāo)本測序失敗可能與前期標(biāo)本處理有關(guān)，TaqMan-MGB法則利用MGB探針標(biāo)記不同基因型的探針，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中完成，無需電泳等后處理，利用TaqMan方法學(xué)特點(diǎn)大大提高了其方法學(xué)的特異度和靈敏度。

為了評(píng)價(jià)TaqMan-MGB法和基因序列測序兩種檢測方法的一致性，本研究中98例標(biāo)本均經(jīng)兩者方法獨(dú)立檢測，進(jìn)行ACTN3基因 R577X分型，檢測結(jié)果經(jīng) Kappa分析，Kappa=0.99，一般認(rèn)為Kappa 值越大，則兩種方法的一致性就越好，如果Kappa 值≥0.75,說明兩種方法一致性較好；如果Kappa 值<0.40，則表明兩種方法一致性不夠理想。

綜上所述，本研究建立的檢測ACTN3基因 R577X多態(tài)性的TaqMan-MGB法適用于杰出運(yùn)動(dòng)員能力的預(yù)測以及運(yùn)動(dòng)候選基因選材的研究。

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Detection of R577X polymorphism of ACTN3 gene by TaqMan-MGB

ZHANGZhi-ming1,GAOPeng-hua2,HULiao-liao3,etal.

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,Xi'anCentralHospital,Xi'an710003,China;2.DepartmentofPhysicalEducation,NorthwesternUniversity;3.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity)

Objective To develop a TaqMan-MGB probe method for the detection of R577X gene polymorphism in ACTN3 gene.Methods Designed to detect the ACTN3 R577X polymorphism of specific primers and TaqMan MGB probe,according to the National Library of Medicine published on the website of human ACTN3 gene sequence rs1815739,to establish and optimize the experimental conditions.Results 98 cases of Northwestern University Students of Han nationality of ACTN3 R577X polymorphism detection,and in all the specimens and sequence,two methods of detection results by kappa analysis,Kappa=0.99.Conclusion The results of the two methods are in good agreement,and the TaqMan-MGB method for the detection of R577X gene polymorphism in ACTN3 gene was established.

real time fluorescence quantitative;ACTN3;gene polymorphism

陜西省體育局常規(guī)課題(15019)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0831-03

R392

A

張志明(1976-)，男，碩士，副主任檢驗(yàn)師，研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)。

2016-04-15)