郭海林 賈智明 鮑星奇 謝華 陳方

長期以來，供體緊缺和移植排斥反應是阻礙器官移植發(fā)展的兩大瓶頸。組織工程學概念的提出為解決上述難題提供了新思路。組織工程學是基于細胞生物學、材料科學及生物工程學的原理在體外構建具有生物活性的組織類似物以替代、修復、改善或再生人體受損或病變的各種組織器官[1-2]。傳統(tǒng)組織工程技術主要為細胞懸液注射和支架材料復合細胞技術，兩種技術各有其優(yōu)勢及缺陷：細胞懸液注射操作方便，創(chuàng)傷小，但單次注射細胞數量有限，難以定位，注射后細胞易流失，無法實現均勻分布，為了滿足細胞數目要求，常需反復多次注射[3]；支架材料復合細胞負載細胞數目相對較高，亦可將細胞移植至特定部位，但支架材料復合細胞需胰酶消化，胰酶會破壞細胞的表面蛋白、胞間連接及細胞外基質（extracellular matrix，ECM），對細胞損傷較大，且支架材料在移植至組織修復部位后會因自身降解而產生炎癥反應，從而不利于細胞的存活和生長[4-5]。

近年興起的細胞膜片技術可有效避免傳統(tǒng)組織工程技術的相關不足，它無需胰酶消化，細胞通過其自身分泌的ECM而自發(fā)地形成致密膜片樣組織，其不僅可避免外源性支架材料所引起的移植排斥反應，而且與細胞懸液注射相比膜片內細胞數目多，存活時間長，是進行組織修復和改善器官功能的良好移植物[3-6]。目前細胞膜片技術已成為組織工程領域的研究熱點，并已被成功應用到包括角膜、軟骨、牙周韌帶、食管及心臟等各種組織器官修復中[1,7-10]。本文將對細胞膜片技術在組織工程中的研究現狀及最新進展做一綜述。

一、細胞膜片的收獲

細胞膜片可通過多種方法收獲，如通過Vitamin C刺激ECM分泌而形成細胞膜片，通過溫度敏感材料、光敏感材料、電敏感材料或聚合人纖維蛋白等包被培養(yǎng)皿而收獲細胞膜片[1,11-12]。由日本學者Okano等[1,9,13]提出的利用溫度敏感型培養(yǎng)皿獲得細胞膜片是目前被應用最廣的方法。溫度敏感型培養(yǎng)皿主要由特殊的溫度敏感材料聚N-異丙基丙烯酰胺（poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm）經電子束照射而共價結合于普通培養(yǎng)皿底部。此溫度敏感材料可根據外在環(huán)境溫度變化而改變其親水及疏水性能，在37 ℃細胞培養(yǎng)環(huán)境中，此溫度敏感材料為疏水性，可使接種細胞正常貼壁增殖，當環(huán)境溫度低于臨界溫度32 ℃時，此溫度敏感材料變?yōu)橛H水性。因此待37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)的細胞長滿培養(yǎng)皿底部時，通過降溫而使溫度敏感材料由疏水性變?yōu)橛H水性，此時貼滿培養(yǎng)皿底部的細胞即可自動脫壁并依靠其自身分泌的ECM而形成具有二維結構（two dimensional，2D）的單張細胞膜片[6,9-10]。這種在溫度敏感型培養(yǎng)皿內收獲細胞膜片的方法避免了胰酶及分散酶的消化，細胞的表面蛋白、胞間連接、ECM、細胞與細胞及細胞與ECM間的相互作用可以被很好地保留，因此基于溫度敏感型培養(yǎng)皿獲得的細胞膜片可能蘊含了更多的生物學信息[6,10]。然而，應用溫度敏感型培養(yǎng)皿獲得細胞膜片亦具有諸多不足：首先，這種由PIPAAm包被的溫度敏感型培養(yǎng)皿至少需要40 min的20 ℃低溫環(huán)境來獲取細胞膜片，相對較費時；其次，對一些較敏感的細胞系來說，通過溫度變化來獲取細胞膜片可能會對細胞的基因表達及細胞功能產生一定影響；再者，制備PIPAAm包被的溫度敏感型培養(yǎng)皿需要電子束輻射設備或氣相聚合裝置，而這些設備在一些生物實驗室中并不常用，且包被過程復雜，需要特殊的材料，因而不利于其大規(guī)模普及[12-13]。因此，目前有研究者正嘗試通過對PIPAAm修飾改性以期可更快、更高效地收獲細胞膜片[14]。

二、細胞膜片與3D組織構建

目前應用溫度敏感型培養(yǎng)皿只可獲得單張2D的細胞膜片。2D的細胞膜片在少部分組織器官（如角膜）修復中具有較大優(yōu)勢，而對于大多數組織器官特別是富細胞的組織器官（如心臟、肝、膀胱和腎臟等）常需要應用3D組織來修復。細胞膜片因含有豐富的ECM、層粘連蛋白及纖連蛋白，故而無需縫合便可緊密貼附在其他細胞膜片、器官組織及生物醫(yī)學材料表面，且膜片內細胞可被其自身分泌的ECM固定很少流失，以上特性為多張細胞膜片復合而形成富細胞的3D組織提供了良好基礎[10,15]。且基于細胞膜片疊加形成的3D組織與單張2D的細胞膜片相比，3D組織可更好地模擬體內組織的生長條件，應用3D組織行組織修復可更有效地促進組織再生，提高組織功能及治療效果[4,10,16]。此外，由不同細胞分別形成的細胞膜片可按預設的結構層次先后完成疊加有望實現組織器官的仿生構建和修復。如Zhou等[16]分別將脂肪干誘導成肌膜片、成纖維細胞膜片及口腔黏膜上皮細胞膜片依次疊加而構建了具有黏膜層、黏膜下層及平滑肌層的3D仿生尿道組織，將其用于犬尿道的修復重建獲得良好效果，實現了組織器官的仿生修復。因此，基于細胞膜片疊加形成的3D仿生組織在組織工程中具有更大的應用潛能。

通過細胞膜片疊加雖可形成3D組織，但如何在疊加形成的3D組織內構建血管網絡以促使其在植入體內后可盡快地與宿主的血管系統(tǒng)建立血運聯(lián)系而不影響其存活是基于細胞膜片技術構建3D組織面臨的重要挑戰(zhàn)[1,17]。通常單純細胞膜片不會自行生成血管，內皮細胞（endothelial cell，EC）對于促進3D組織中新血管再生起著關鍵作用[18-19]。Sasagawa等[19]應用“三明治法”將人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）間置在5層成肌細胞膜片間，在體外培養(yǎng)環(huán)境中，HUVECs會以出芽方式在組織內形成血管網絡。將5層成肌細胞膜片植入裸鼠皮下發(fā)現，成肌細胞膜片內的內皮血管網絡會與宿主的血管建立血運聯(lián)系進而支持體外構建的3D組織的存活。此外，心肌細胞與EC共培養(yǎng)形成膜片后再疊加或成纖維細胞與EC分別形成膜片后再疊加也可構建血管化的3D組織[10,20]。結合細胞膜片技術構建血管化的3D組織，是一項具有巨大潛力的組織工程血管化新策略[17-18,21]，更有利于其在植入體內后的早期存活，促進組織器官修復和改善器官功能。

三、細胞膜片技術在組織修復中的應用

目前細胞膜片技術較多地被應用于角膜、食管、牙周韌帶及心臟等組織修復中，且單張細胞膜片已被臨床應用于角膜、食管的修復，多張細胞膜片亦被應用到心肌、牙周及軟骨組織的修復，證實了細胞膜片技術在組織修復中的潛在臨床應用價值。

當單側眼角膜緣干細胞出現病變時，另一側的角膜緣干細胞可用于病變側眼的修復，但存在對健側眼角膜緣干細胞造成損傷的風險。當雙側眼角膜緣干細胞均出現病變時，可采用口腔黏膜上皮細胞膜片進行修復。口腔黏膜上皮細胞膜片含有干細胞或祖細胞樣細胞，可抑制角膜內的炎癥反應，恢復角膜的清潔和平滑[1]。在臨床應用中，Nishida等[22]將自體的口腔黏膜上皮細胞膜片用于4例雙側眼角膜緣干細胞缺陷的患者獲得了良好的治療效果。臨床試驗的成功正促使細胞膜片的產品化獲得市場授權[23]。

細胞膜片技術在擴張性心肌病及缺血性心肌病導致的嚴重心衰中亦具有重要的應用價值。Sawa等[24]報道了1例應用成肌細胞膜片治療擴張性心肌病需左室輔助系統(tǒng)（left ventricular assist system，LVAS）支持的患者，他們將20張成肌細胞膜片分5處貼附（每處貼附4張疊加的成肌細胞膜片）在左心室的前壁和側壁上，3個月后發(fā)現成肌細胞膜片提高了心臟功能，使心衰導致的癥狀完全消失，患者亦無需LVAS支持。在一項同樣應用成肌細胞膜片修復鼠心肌梗死模型的研究中發(fā)現，成肌細胞膜片可通過旁分泌多種生長因子來提高病變心臟的功能，并減少缺血性心肌纖維化[25]。據此推測，成肌細胞膜片在臨床應用中改善擴張性心肌病患者心臟功能的機制應該也與成肌細胞膜片的旁分泌效應相關[1]。

內鏡下黏膜切除（endoscopic submucosal dissection，ESD）是治療早期淺表性食管癌的有效措施，然而在食管黏膜切除范圍較大時可出現炎癥反應和食管狹窄等并發(fā)癥。經基礎研究證實，口腔黏膜上皮細胞膜片貼附在行ESD術后的基底組織創(chuàng)面上可有效減少食管狹窄的發(fā)生[26]。Ohki等[7]將口腔黏膜上皮細胞膜片貼附在10例行ESD患者的基底組織創(chuàng)面上證實了同樣的結果。新近研究發(fā)現，應用皮膚表皮細胞膜片同樣可有效減少術后食管狹窄的發(fā)生，為防止ESD術后食管狹窄的發(fā)生提供了新的組織來源[27]。

綜上所述，細胞膜片技術自誕生以來獲得了突飛猛進的發(fā)展，而且在心臟、食管和角膜修復方面已經積累了相應臨床經驗。除此以外，應用牙周組織細胞膜片促進牙周組織再生及應用軟骨細胞膜片修復骨關節(jié)炎導致的軟骨缺損的臨床試驗亦在進行中[1,8]。隨著細胞膜片技術研究的深入，越來越多的器官病變或組織缺損可應用細胞膜片技術進行修復，細胞膜片技術在修復組織缺損或改善器官功能方面具有巨大的臨床應用潛能。

四、細胞膜片技術應用新領域

目前細胞膜片技術在心臟、食管、角膜、牙周及軟骨等組織工程領域報道較多。隨著細胞膜片技術應用領域的不斷拓展，近年來一些較少見組織器官的病變亦開始應用細胞膜片技術來修復。

中耳炎術后導致的中耳黏膜缺損會導致鼓膜回縮和粘連的復發(fā)，如果可在骨的表面盡快地使上皮再生，可有效防止術后鼓膜粘連。Yaguchi等[28]采用自體中耳黏膜細胞膜片修補新西蘭大白兔中耳炎手術后造成的黏膜缺損和骨暴露，不僅可恢復中耳黏膜連續(xù)性，還可有效抑制術后肉芽組織生長和骨質增生，減少手術并發(fā)癥。然而中耳黏膜取材相對較難，且在臨床工作中不宜將健側耳黏膜切除去修復患側耳黏膜缺損。Yamamoto等[29]研究發(fā)現將鼻黏膜上皮細胞膜片覆蓋在中耳炎術后導致的骨暴露處同樣可抑制骨質增生，增大鼓室容積，促進中耳上皮恢復，為鼻黏膜上皮細胞膜片在中耳炎手術中的應用奠定了基礎。與中耳黏膜相比，鼻黏膜取材創(chuàng)傷對機體功能影響較小，且鼻黏膜上皮特點與中耳黏膜上皮類似，更適于臨床推廣，因此鼻黏膜上皮細胞膜片在中耳炎術后防止鼓膜粘連方面具有更大的應用潛能。細胞膜片除了可防止中耳炎術后導致的鼓膜粘連，其在防止宮腔粘連及腹腔粘連方面亦有相關報道[30-31]。

近年來細胞膜片在治療胸膜瘺方面亦有相關報道。如Kanzaki等[32]將豬皮膚成纖維細胞膜片貼附在臟胸膜破損處可使胸膜瘺立即關閉。4周后發(fā)現成纖維細胞膜片仍貼附在胸膜表面，并可隨著肺通氣造成的肺容量變化而發(fā)生擴張和收縮，從而為胸膜缺損提供了新的有效閉合措施。另外，有學者證明成肌細胞膜片在胰瘺及胃穿孔閉合方面亦有潛在的應用價值[33-34]。

除可修復組織缺損外，細胞膜片技術在促血管化構建、疾病機制研究及腫瘤模型構建方面亦有相關報道。如Kato等[35]將脂肪干細胞膜片貼附在2型糖尿病大鼠頭部全厚皮膚缺損創(chuàng)面上，脂肪干細胞膜片可通過分泌多種促血管生成因子來促進創(chuàng)面組織的血管化進而促進人造皮膚的存活。Chen等[36]發(fā)現將臍靜脈內皮細胞以20 000/cm2密度種植在人間充質干細胞膜片上并在常氧環(huán)境下（20% O2）培養(yǎng)1周可獲得預血管化的間充質干細胞膜片，與單純間充質干細胞膜片相比，其分泌生長因子更多，促缺損組織創(chuàng)面血管床優(yōu)化更明顯，進而也可使貼附其上的自體中厚皮片攣縮更少。Sekine等[37]將新生大鼠的心肌細胞膜片環(huán)形包繞在切除下來的成年大鼠胸主動脈，使其黏附并形成心肌管道，再將該心肌管道替代裸鼠的腹主動脈。4周后發(fā)現該心肌管道可自發(fā)地節(jié)律性搏動，使心肌管道內產生約（5.9 ±1.7） mmHg的壓力（1 mm Hg = 0.133 kPa），并且血流的機械壓力會使血管外的心肌細胞發(fā)生肥大和增生。這種體外細胞膜片技術構建的心肌管道不僅可為心衰的機制研究提供幫助，更為心臟支持設備研究提供了一種新的途徑。另外，細胞膜片技術在腫瘤模型構建方面亦有相關應用。如Suzuki等[38]發(fā)現與傳統(tǒng)的單純癌細胞懸液皮下注射成瘤相比，腫瘤細胞膜片移植成瘤速度更快，且同等時間內成瘤體積更大，因而可為腫瘤模型構建、新藥研發(fā)及抗腫瘤治療研究提供新思路。

五、總結

盡管細胞膜片技術在保留細胞表面蛋白、胞間連接、ECM、細胞與細胞間及細胞與ECM間相互作用方面具有較多優(yōu)勢，但目前仍存在一些不足之處：第一，單張細胞膜片相對薄，易碎，機械性能欠佳，易卷縮，轉移和運輸較困難，難以直接移植，常需使用一定的運載輔助工具完成移植；第二，細胞膜片培養(yǎng)周期較長，文獻報道7 ～ 28 d不等，培養(yǎng)成本較高，且在培養(yǎng)過程中只換液不傳代，細胞狀態(tài)難以質量控制，難以滿足大規(guī)模生產滿足臨床應用；第三，單純細胞膜片通常不會自行生成血管，對于多層細胞膜片用于修復較大的富細胞的組織缺損時，常需構建預血管化的組織并采用多次手術的方式以保證其移植修復后的營養(yǎng)供給，多次手術創(chuàng)傷較大，不利于臨床應用推廣；第四，細胞膜片難以塑形，如需修復特定形態(tài)的組織缺損常需將細胞膜片技術與支架材料相結合，而支架材料的降解不利于細胞的存活及移植修復部位的組織學優(yōu)化，如何將細胞膜片有效塑形亦是其在組織工程研究中面臨的又一挑戰(zhàn)。

細胞膜片技術在組織工程中的應用研究方興未艾，且有些研究已經進入到臨床階段。與傳統(tǒng)組織工程技術相比，基于細胞膜片技術構建的組織保留了更多的生物學信息，因此新的組織器官模型及腫瘤模型亦開始結合細胞膜片技術來進行構建。但應用細胞膜片技術構建血管化的大塊組織及基于細胞膜片技術進行全器官的替代移植仍是非常遙遠的事情，其需要細胞生物學、生物工程學、臨床醫(yī)學及商業(yè)部門的共同參與才有望早日實現其工業(yè)化進程。期待能有更多的創(chuàng)新性手段融入到細胞膜片技術上來，以實現其工業(yè)化進程及全器官的替代移植。

1 Owaki T, Shimizu T, Yamato M, et al. Cell sheet engineering for regenerative medicine： current challenges and strategies[J]. Biotechnol J, 2014, 9(7)：904-914.

2 郭海林. 組織工程尿道重建從基礎到臨床應用的反思[J]. 現代泌尿外科雜志, 2016, 21(2)：152-155, 158.

3 Takeuchi R, Kuruma Y, Sekine H, et al.In vivovascularization of cell sheets provided better long-term tissue survival than injection of cell suspension[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2016, 10(8)：700-710.

4 Masuda S, Shimizu T. Three-dimensional cardiac tissue fabrication based on cell sheet technology[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2016, 96：103-109.

5 Rahmi G, Pidial L, Silva AK, et al. Designing 3D mesenchymal stem cell sheets merging magnetic and fl uorescent features： when cell sheet technology meets Image-Guided cell therapy[J]. Theranostics, 2016,6(5)：739-751.

6 Osada A, Sekine H, Soejima K, et al. Harvesting epithelial keratinocyte sheets from temperature-responsive dishes preserves basement membrane proteins and improves cell survival in a skin defect model[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2017, 11(9)：2516-2524.

7 Ohki T, Yamato M, Ota M, et al. Application of regenerative medical technology using tissue-engineered cell sheets for endoscopic submucosal dissection of esophageal neoplasms[J]. Dig Endosc, 2015,27(2)：182-188.

8 Iwata T, Washio K, Yoshida T, et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration[J]. J Tissue Eng Regen Med,2015, 9(4)：343-356.

9 Matsuura K, Utoh R, Nagase K, et al. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine[J]. J Control Release, 2014,190：228-239.

10 Sakaguchi K, Shimizu T, Okano T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering[J]. J Control Release, 2015, 205：83-88.

11 Patel NG, Zhang G. Responsive systems for cell sheet detachment[J].Organogenesis, 2013, 9(2)：93-100.

12 Juthani N, Howell C, Ledoux H, et al. Infused polymers for cell sheet release[J]. Sci Rep, 2016, 6：26109.

13 周術奎, 張楷樂, 王營, 等. 細胞膜片技術在組織工程中的應用與研究進展[J]. 中國組織工程研究, 2016, 20(11)：1630-1636.

14 Sakuma M, Kumashiro Y, Nakayama M, et al. Preparation of thermoresponsive nanostructured surfaces for tissue engineering[J]. J Vis Exp, 2016, (109)：e53465.

15 Haraguchi Y, Shimizu T, Sasagawa T, et al. Fabrication of functional three-dimensional tissues by stacking cell sheetsin vitro[J]. Nat Protoc,2012, 7(5)：850-858.

16 Zhou S, Yang R, Zou Q, et al. Fabrication of Tissue-Engineered bionic urethra using cell sheet technology and labeling by ultrasmall superparamagnetic Iron oxide for Full-Thickness urethral Reconstruction[J]. Theranostics, 2017, 7(9)：2509-2523.

17 Moschouris K, Firoozi N, Kang Y. The application of cell sheet engineering in the vascularization of tissue regeneration[J]. Regen Med, 2016, 11(6)：559-570.

18 陳佳, 馬東洋, 任利玲. 細胞膜片技術在構建工程化血管化組織中的應用進展[J]. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(3)：368-371.

19 Sasagawa T, Shimizu T, Sekiya S, et al. Design of prevascularized three-dimensional cell-dense tissues using a cell sheet stacking manipulation technology[J]. Biomaterials, 2010, 31(7)：1646-1654.

20 Asakawa N, Shimizu T, Tsuda Y, et al. Pre-vascularization of in vitro three-dimensional tissues created by cell sheet engineering[J].Biomaterials, 2010, 31(14)：3903-3909.

21 Laschke MW, Menger MD. Prevascularization in tissue engineering：Current concepts and future directions[J]. Biotechnol Adv, 2016,34(2)：112-121.

22 Nishida K, Yamato M, Hayashida Y, et al. Corneal Reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium[J]. N Engl J Med, 2004, 351(12)：1187-1196.

23 Burillon C, Huot L, Justin V, et al. Cultured autologous oral mucosal epithelial cell sheet (CAOMECS) transplantation for the treatment of corneal limbal epithelial stem cell defi ciency[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2012, 53(3)：1325-1331.

24 Sawa Y, Miyagawa S, Sakaguchi T, et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM： report of a case[J]. Surg Today, 2012,42(2)：181-184.

25 Sawa Y, Miyagawa S. Present and future perspectives on cell sheetbased myocardial regeneration therapy[J]. Biomed Res Int, 2013, 2013(3)：583912.

26 Ohki T, Yamato M, Murakami D, et al. Treatment of oesophageal ulcerations using endoscopic transplantation of tissue-engineered autologous oral mucosal epithelial cell sheets in a canine model[J].Gut, 2006, 55(12)：1704-1710.

27 Kanai N, Yamato M, Ohki T, et al. Fabricated autologous epidermal cell sheets for the prevention of esophageal stricture after circumferential ESD in a porcine model[J]. Gastrointest Endosc, 2012, 76(4)：873-881.

28 Yaguchi Y, Murakami D, Yamato M, et al. Middle ear mucosal regeneration with three-dimensionally tissue-engineered autologous middle ear cell sheets in rabbit model[J]. J Tissue Eng Regen Med,2016, 10(3)：E188-E194.

29 Yamamoto K, Hama T, Yamato M, et al. The effect of transplantation of nasal mucosal epithelial cell sheets after middle ear surgery in a rabbit model[J]. Biomaterials, 2015, 42：87-93.

30 Kawanishi K, Yamato M, Sakiyama R, et al. Peritoneal cell sheets composed of mesothelial cells and fi broblasts prevent intra-abdominal adhesion formation in a rat model[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2016,10(10)：855-866.

31 Kuramoto G, Takagi S, Ishitani K, et al. Preventive effect of oral mucosal epithelial cell sheets on intrauterine adhesions[J]. Hum Reprod, 2015, 30(2)：406-416.

32 Kanzaki M, Yamato M, Yang J, et al. Functional closure of visceral pleural defects by autologous tissue engineered cell sheets[J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2008, 34(4)：864-869.

33 Tanaka S, Kanetaka K, Fujii M, et al. Cell sheet technology for the regeneration of gastrointestinal tissue using a novel gastric perforation rat model[J]. Surg Today, 2017, 47(1)：114-121.

34 Tanaka T, Kuroki T, Adachi T, et al. Development of a novel rat model with pancreatic fi stula and the prevention of this complication using tissue-engineered myoblast sheets[J]. J Gastroenterol, 2013,48(9)：1081-1089.

35 Kato Y, Iwata T, Morikawa S, et al. Allogeneic transplantation of an Adipose-Derived stem cell sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity[J]. Diabetes, 2015, 64(8)：2723-2734.

36 Chen L, Xing Q, Zhai Q, et al. Pre-vascularization Enhances Therapeutic Effects of Human Mesenchymal Stem Cell Sheets in Full Thickness Skin Wound Repair[J]. Theranostics, 2017, 7(1)：117-131.

37 Sekine H, Shimizu T, Yang J, et al. Pulsatile myocardial tubes fabricated with cell sheet engineering[J]. Circulation, 2006, 114(1 Suppl)：I87-I93.

38 Suzuki R, Aruga A, Kobayashi H, et al. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering[J]. Anticancer Res, 2014,34(9)：4747-4754.