王澤宇 張亮 陳濤 黃澤楠 馮新民

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是源于中胚層的成體干細(xì)胞的總稱，目前發(fā)現(xiàn)骨髓、臍帶、脂肪中均存在自身MSCs[1-2]。MSCs可以在體外形成脂肪、軟骨、骨骼、肌肉和皮膚等，因此在組織再生與修復(fù)中具有巨大潛力[1-2]。細(xì)胞自噬（autophagy）是胞質(zhì)內(nèi)生物大分子和細(xì)胞器被具有雙層膜的自噬體包裹，并送入溶酶體進(jìn)行降解的一種過程，廣泛存在于真核細(xì)胞生物和哺乳動物[3-4]。

近年來，自噬已成為研究熱點(diǎn)，越來越多的研究表明，自噬是調(diào)節(jié)對細(xì)胞應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)并有助于維持生理?xiàng)l件下細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵過程。本文就自噬在MSCs研究中的進(jìn)展做一綜述。

一、自噬的定義、分類及主要功能

（一）自噬的定義及分類

自噬是在缺氧、營養(yǎng)剝奪、代謝、氧化應(yīng)激和蛋白毒性等應(yīng)激下，由自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG）調(diào)控，細(xì)胞經(jīng)由溶酶體分解細(xì)胞器和蛋白等物質(zhì)的過程[3-4]。在這個過程當(dāng)中有最重要的2個步驟：首先是胞內(nèi)的靶向物被膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬小泡；然后所形成的自噬小泡與溶酶體結(jié)合，形成自噬溶酶體對胞內(nèi)靶向物質(zhì)進(jìn)行降解。

自噬的分解代謝和降解過程可分為3種不同形式：（1）分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）：這種自噬對細(xì)胞器無降解作用，一般只降解胞漿中蛋白質(zhì)成分，具有高度選擇性，往往在長時間饑餓的條件下出現(xiàn)[4]；（2）微自噬（microautophagy）：通過溶酶體主動吞噬的方式將胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)直接吞入溶酶體進(jìn)行降解，在饑餓或雷帕霉素誘導(dǎo)時發(fā)生[5]；（3）巨自噬（macroautophagy）：當(dāng)外界刺激信號作用到細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)可形成吞噬泡的雙層膜結(jié)構(gòu)，并擴(kuò)張延伸最后包裹細(xì)胞質(zhì)和部分待降解的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)[6]。

（二）自噬的主要功能

自噬的主要功能如下[3-6]：（1）維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)：吞噬并降解從而達(dá)到更新線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等一些細(xì)胞器的目的，并維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；（2）維持細(xì)胞存活：當(dāng)外界環(huán)境變化時，自噬可以為細(xì)胞提供所需的游離脂肪酸、核苷酸、氨基酸等一些可再利用物質(zhì)，從而適應(yīng)外界環(huán)境的變化；（3）參與部分組織的重構(gòu)：自噬掃除細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器及某些代謝產(chǎn)物，并幫助細(xì)胞重構(gòu)；（4）誘導(dǎo)細(xì)胞死亡：當(dāng)自噬機(jī)制被激活并開啟后可主動引起細(xì)胞死亡。

二、自噬在MSCs功能特性維持中的作用

在多種MSCs的增殖、分化及干性基因維持等方面自噬都發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。哺乳動物的微管相關(guān)蛋白輕鏈3（light chain 3，LC3）是酵母菌ATG8的同源蛋白，包含LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ形式，其中LC3-Ⅱ是目前發(fā)現(xiàn)的唯一定位在自噬體和自噬溶酶體膜上的蛋白質(zhì)，其含量多少與自噬泡數(shù)量成正比，是較特異的自噬指標(biāo)[7]。在MSCs中，在LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ的過程中證實(shí)存在自噬的大量激活，并且其激活可能依賴于抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-X1[8]。因此，大量研究致力于各種細(xì)胞內(nèi)外刺激因素誘導(dǎo)的自噬在干細(xì)胞干性維持及存活中的作用[9]。

（一）高糖狀態(tài)

由糖尿病和代謝綜合征引起的高血糖會導(dǎo)致血管和器官功能障礙，已成為危害人類健康的主要問題。Zhao等[10]研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以顯著緩解胰腺INS-1細(xì)胞的葡萄糖源性的細(xì)胞毒性，但自噬的激活顯著抑制了BMSCs對β細(xì)胞的保護(hù)作用。此外，臍帶MSCs可能通過誘導(dǎo)受損細(xì)胞自噬加速糖尿病患者創(chuàng)面愈合過程[11]。Chang等[12]發(fā)現(xiàn)高糖可以誘導(dǎo)BMSCs衰老，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少，從而影響干細(xì)胞微環(huán)境的功能使得造血功能受損；同時高糖誘導(dǎo)的BMSCs衰老可以釋放促炎性因子，從而誘發(fā)局部炎癥及組織損傷。

（二）衰老

高糖環(huán)境下培養(yǎng)的BMSCs會出現(xiàn)細(xì)胞早衰、基因組不穩(wěn)定及端粒改變，自噬對處于應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞具有保護(hù)作用[12]。通過上調(diào)Beclin-1、ATG5及ATG7表達(dá)實(shí)現(xiàn)的自噬激活，以及增加的LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化與BMSCs衰老相關(guān)；通過3-甲基腺嘌呤抑制自噬可以減少細(xì)胞衰老。當(dāng)細(xì)胞衰老時，細(xì)胞在形態(tài)上變大變平，最終停止分裂；同時失去干細(xì)胞特征，從而影響干細(xì)胞的臨床應(yīng)用[13]。雖然在干細(xì)胞衰老過程中明確存在自噬過程，但自噬在干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及干性維持上的作用仍存在爭議。研究發(fā)現(xiàn)敲除ATG基因會加速細(xì)胞衰老，而致癌應(yīng)激可以通過激活自噬誘導(dǎo)干細(xì)胞衰老[14-15]。自噬是一種應(yīng)激適應(yīng)反應(yīng)，可以避免細(xì)胞死亡及抑制細(xì)胞凋亡，構(gòu)成可替代的細(xì)胞死亡途徑。因此一定范圍的自噬可以預(yù)防細(xì)胞衰老，而過量的自噬激活則可縮短細(xì)胞壽命。

干細(xì)胞衰老的潛在分子機(jī)制，尤其是與自噬相互疊加的部分仍不明確。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子及抑癌因子p53的增加與BMSCs的衰老相關(guān)，并且可以調(diào)控BMSCs的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及基因穩(wěn)定性[16]。敲除p53基因?qū)е翷C3-Ⅱ轉(zhuǎn)化減少及mTOR表達(dá)上調(diào)，因此p53基因是BMSCs的體外擴(kuò)增自噬過程中必不可少的因素[17]。盡管目前細(xì)胞衰老方面的研究已取得重要進(jìn)展，但在細(xì)胞壽命研究中的自噬及具體的分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

（三）氧化應(yīng)激損傷

為維持干細(xì)胞的干性，干細(xì)胞通過建立局部低氧微環(huán)境來主動延緩衰老[18]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）的主要來源是受損的線粒體，可以通過干細(xì)胞的線粒體自噬途徑去除ROS[19]。研究表明饑餓及雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬可以減少由放射損傷導(dǎo)致的ROS及DNA損傷，從而實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的干性維持；而抑制自噬將導(dǎo)致ROS集聚及DNA損傷，最終導(dǎo)致干細(xì)胞的干性丟失[20]。另外，對于放射損傷對MSCs的影響，研究發(fā)現(xiàn)抑制放射誘導(dǎo)的自噬后，BMSCs凋亡明顯增加；增強(qiáng)放射誘導(dǎo)的自噬后，盡管凋亡比例未下降，但自噬向凋亡的轉(zhuǎn)化被拮抗，因而自噬可能對BMSCs具有放射保護(hù)作用[21]。因此自噬增加可能減少氧化應(yīng)激等損傷造成的MSCs凋亡，延長干細(xì)胞的存活。

（四）低氧

在調(diào)節(jié)干細(xì)胞存活及維持干細(xì)胞干性的細(xì)胞外因素中，干細(xì)胞微環(huán)境的理化性質(zhì)如氧張力、滲透壓及pH值對干細(xì)胞的生物學(xué)行為及分化具有重要影響[22]。低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[23]，通過影響血管的形成和功能改善局部微環(huán)境，通過糖酵解途徑調(diào)節(jié)O2的利用。

低氧可以通過AMPK/mTOR信號通路激活BMSCs的自噬。在自噬抑制劑3甲基腺嘌呤存在下，干細(xì)胞自噬的激活將會導(dǎo)致TUNEL陽性細(xì)胞減少，從而出現(xiàn)低氧誘導(dǎo)的凋亡，而雷帕霉素則可促進(jìn)自噬[8,24-25]。但Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在3甲基腺嘌呤存在下低氧誘導(dǎo)的凋亡增加，而雷帕霉素則可減少自噬，說明自噬可能在低氧誘導(dǎo)的MSCs凋亡中發(fā)揮保護(hù)作用；另有研究表明低氧通過自噬及apelin（一種線粒體源性的神經(jīng)肽）促進(jìn)BMSCs增殖[27]。以上研究結(jié)果不同的原因可能是由于干細(xì)胞的部位特異性決定的，如脛骨來源的BMSCs具有更強(qiáng)的干細(xì)胞干性基因表面標(biāo)志Nanog、Oct-4 及Sox2表達(dá)，在常氧及低氧狀態(tài)下具有更強(qiáng)的自噬和抗衰老能力[28]。

（五）pH

干細(xì)胞微環(huán)境的pH值影響MSCs的增殖、分化及旁分泌活性。生理?xiàng)l件下外周血pH值約為7.35 ～ 7.4，而細(xì)胞內(nèi)液及細(xì)胞外液pH值較低，且pH值容易因細(xì)胞代謝而改變。細(xì)胞糖酵解和氧化代謝增加產(chǎn)生大量碳酸和乳酸，導(dǎo)致細(xì)胞外酸中毒，細(xì)胞將代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)排出細(xì)胞外維持細(xì)胞內(nèi)pH值在正常范圍。因此在細(xì)胞膜內(nèi)外出現(xiàn)了pH梯度變化：細(xì)胞外pH值低于細(xì)胞內(nèi)pH[29]值。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以通過自噬機(jī)制適應(yīng)酸中毒[30]。雖然細(xì)胞外酸中毒可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞表型維持，但局部酸性環(huán)境能夠誘導(dǎo)正常干細(xì)胞維持干性未被證實(shí)。因此，細(xì)胞外酸中毒與MSCs生物學(xué)行為的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步研究。

酸性微環(huán)境可以調(diào)節(jié)MSCs的干性及再生能力。自噬與干細(xì)胞的干性特征、細(xì)胞衰老及死亡的調(diào)節(jié)相關(guān)，而酸性環(huán)境可以誘導(dǎo)自噬發(fā)生[31]。Sbrana等[32]在酸性條件下培養(yǎng)MSCs，通過檢測pH6.8的酸性環(huán)境或pH7.4中性環(huán)境下LC3-Ⅱ、p62及Beclin1等典型的自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)來評估BMSCs的自噬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)環(huán)境中均檢測到BMSCs的自噬，且兩種環(huán)境下無明顯差別，說明自噬并不是MSCs面對酸性微環(huán)境的主要調(diào)節(jié)適應(yīng)機(jī)制。

三、自噬在MSCs分化中的作用

成骨細(xì)胞系的MSCs通常具備成骨、成軟骨及成脂分化能力。不同局部微環(huán)境（細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架張力、細(xì)胞黏附性及機(jī)械或結(jié)構(gòu)細(xì)胞性質(zhì)）可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞向不同譜系細(xì)胞分化。低密度干細(xì)胞傾向于向成骨細(xì)胞分化，高密度細(xì)胞使得細(xì)胞易凝結(jié)并向成脂細(xì)胞分化。細(xì)胞形態(tài)通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性Rho GTP酶（RhoA）活性來調(diào)節(jié)成脂—成骨分化轉(zhuǎn)換，RhoA陰性使MSCs向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而RhoA陽性則向成骨細(xì)胞分化[33]。

自噬在MSCs的分化（尤其是成骨分化）中發(fā)揮重要作用。Nuschke等[34]發(fā)現(xiàn)在未分化的MSCs中存在未退變的自噬泡的集聚及少量自噬轉(zhuǎn)化，而促進(jìn)成骨分化則可以使得自噬轉(zhuǎn)化持續(xù)增加。因此，自噬可能在MSCs的成骨分化調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過牙髓MSCs的AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）、mTOR、蛋白激酶B（Akt）和自噬標(biāo)記物等基因敲除的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs的成骨分化調(diào)控與早期mTOR抑制及Akt/mTOR信號軸的晚期激活有關(guān)[35]。特異AT序列結(jié)合蛋白2（SATB2）通過上調(diào)多能基因及自噬相關(guān)基因可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化和骨缺損再生，而多能基因及自噬相關(guān)基因又可以激活雷帕霉素信號通路[28]。盡管mTOR信號可能影響MSCs的成骨分化，但雷帕霉素是否可以降低或增加成骨分化的結(jié)果存在爭論。雷帕霉素對大鼠BMSCs無自發(fā)的成骨作用，但可以抑制地塞米松誘發(fā)的成骨分化[36]。

在MSCs的成脂分化研究方面，已知再生障礙性貧血患者BMSCs可由雷帕霉素誘導(dǎo)發(fā)生自噬和凋亡，并且明顯促進(jìn)G1期細(xì)胞周期阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖和降低成脂分化，這些現(xiàn)象的機(jī)制或許與雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路從而激活自噬有關(guān)[37]。在MSCs早期分化期間改變自噬體平衡的藥物治療可以導(dǎo)致MSCs成脂分化效率的變化，雷帕霉素（自噬激活劑）處理可以抑制脂肪細(xì)胞形成，巴弗洛霉素（自噬抑制劑）處理可以加速脂肪積累[34]。

四、自噬在MSCs旁分泌中的作用

MSCs通過自分泌方式分泌的各種生長因子很大程度上可以促進(jìn)MSCs的增殖和分化潛能。其中，成纖維細(xì)胞生長因子（fi broblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）和肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）可以促進(jìn)MSCs的增殖，而HGF可以促進(jìn)MSCs的成脂分化[31]。

研究發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境可以影響牙髓MSCs促進(jìn)的血管化功能，其機(jī)制可能是自噬促進(jìn)牙髓骨髓MSCs中的LC3表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)膜上LC3-Ⅱ增加激活Raf-MEK-ERK信號通路，促使ERK進(jìn)一步發(fā)生磷酸化，并加速牙髓MSCs旁分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，從而使得血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生血管化，進(jìn)而促進(jìn)傷口的愈合[38]。Ni等[39]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及Bcl-2，可以通過抑制細(xì)胞凋亡及自噬，增強(qiáng)細(xì)胞的旁分泌途徑來保護(hù)缺血環(huán)境下的MSCs。

五、自噬在其他干細(xì)胞中的作用

有研究表明，脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ADSCs）在一定外界條件下可分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。雷帕霉素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增加明顯提高ADSCs向軟骨細(xì)胞的分化能力，并且自噬相關(guān)基因Atg5被抑制后ADSCs向軟骨細(xì)胞的分化能力顯著下降[40]。另一方面，在臍帶MSCs中自噬可促進(jìn)CXCR4分泌，通過少量的免疫抑制劑他克莫司及西羅莫司抑制Pl3K/AKt/mTOR信號通路并激活自噬系統(tǒng)。此時，Becline1、Atg5及LC3B自噬相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加，最終導(dǎo)致CXCR4分泌上調(diào)[41]。

六、結(jié)語與展望

自噬在MSCs干性維持的作用為更好的理解及維持干細(xì)胞的活力指明了新的方向，說明MSCs在組織修復(fù)及再生中的應(yīng)用具有巨大潛力。但對于自噬和MSCs之間的關(guān)系及其調(diào)控的分子機(jī)制仍尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究，而這些研究必將會對MSCs的臨床應(yīng)用提供重要的價值。

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