彭韜高水超周媛卿潔徐娟朱綱華楊仕明謝鼎華

1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 中南大學(xué)耳科研究所（長(zhǎng)沙410011）2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 解放軍耳鼻咽喉研究所(北京100853)

·綜 述·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療感音神經(jīng)性耳聾相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系建設(shè)概要

彭韜1高水超1周媛1卿潔1徐娟1朱綱華1楊仕明2謝鼎華1

1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 中南大學(xué)耳科研究所（長(zhǎng)沙410011）2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 解放軍耳鼻咽喉研究所(北京100853)

感音神經(jīng)性耳聾是由于內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞的損傷造成的，其治療一直是耳科醫(yī)生十分棘手的問(wèn)題。近年來(lái)，利用干細(xì)胞修復(fù)內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞在國(guó)內(nèi)外大量的研究中取得了諸多重要進(jìn)展，特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，有易分離、低免疫源性、無(wú)致瘤性等優(yōu)點(diǎn)，極具臨床應(yīng)用價(jià)值。但目前國(guó)內(nèi)外各個(gè)研究小組從干細(xì)胞的制備，誘導(dǎo)到移植內(nèi)耳的方法均有差異，未形成統(tǒng)一的流程，不利于其學(xué)術(shù)交流和實(shí)驗(yàn)結(jié)果大樣本收集。本文集中介紹謝鼎華課題組在國(guó)家973項(xiàng)目干細(xì)胞治療耳聾的實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系標(biāo)準(zhǔn)制定課題的基礎(chǔ)研究方法，并綜述目前本領(lǐng)域國(guó)際最新動(dòng)態(tài)，初步提出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療感音神經(jīng)性耳聾的技術(shù)方法和質(zhì)量控制措施的推薦方案，為最終臨床安全、規(guī)范化運(yùn)用干細(xì)胞治療耳聾提供依據(jù)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；耳聾；實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系

This work was supported by grants from National Basic Research Program of China(973,grant number:2012CB967904, 2012CB967900)and Independent innovation projectof Centralsouth university(grantnumber:2016zzts139)

Theauthors reportno competing financial interests.

耳聾是全球常見疾病，被認(rèn)為是發(fā)達(dá)國(guó)家最普遍的殘疾。2012年，WHO估算全球有3.6億人有殘疾性聽力損傷，其中3200萬(wàn)是兒童（http:// www.who.int/pbd/deafness/estimates/en/）。在當(dāng)前信息社會(huì)中，正常的聽覺(jué)是人們生活、學(xué)習(xí)和社會(huì)交往必不可少的。聽覺(jué)功能主要依賴毛細(xì)胞的感受和與之相連的螺旋神經(jīng)元（spiral ganglion neuron, SGN）的傳導(dǎo)，這兩種內(nèi)耳細(xì)胞的損傷導(dǎo)致永久性的感音神 經(jīng)性聾（Sensorineural hearing loss, SNHL）。目前治療SNHL的方法有人工耳蝸植入和聽覺(jué)腦干植入，但都未能恢復(fù)正常聽覺(jué)結(jié)構(gòu)，治療有一定局限性[1]。因此，國(guó)內(nèi)外的研究者開始將目光轉(zhuǎn)向干細(xì)胞的研究，希望通過(guò)干細(xì)胞來(lái)再生或修復(fù)內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞，從根本上治療SNHL。間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cell,MSC）是一類中胚層來(lái)源的成體干細(xì)胞，存在于骨髓及許多成體器官結(jié)締組織中。骨髓是MSC主要來(lái)源，而且取材方便，所以關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemar?row mesenchymal stem cell,BMSC）的研究最多，是目前能臨床應(yīng)用的為數(shù)不多的一種干細(xì)胞[2]。

先前有報(bào)道利用外源蛋白激活部分信號(hào)通路或者與內(nèi)耳細(xì)胞共培養(yǎng)都能將BMSC轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞[3-5]，BMSC在體外誘導(dǎo)或者直接移植入耳蝸治療感音神經(jīng)性耳聾動(dòng)物模型后[6-8]，獲得了一定的效果，但各個(gè)研究小組從干細(xì)胞的制備，誘導(dǎo)到移植內(nèi)耳的方法均有差異，未形成統(tǒng)一的流程，不利于其學(xué)術(shù)交流和實(shí)驗(yàn)結(jié)果大樣本收集。本文目的在于建立一個(gè)BMSC在感音神經(jīng)性耳聾治療相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的相對(duì)成熟體系，主要對(duì)供體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，干細(xì)胞的制備與鑒定，誘導(dǎo)分化，凍存復(fù)蘇，動(dòng)物模型，移植途徑，細(xì)胞濃度，安全性和有效性這八個(gè)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行重點(diǎn)探索和研發(fā)。

1 供體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

先天性及語(yǔ)前感音神經(jīng)性耳聾主要由遺傳因素（約50%）引起，其次為耳毒性藥物及孕期內(nèi)耳及神經(jīng)發(fā)育干擾因素等。因此對(duì)于供體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，干細(xì)胞供體致聾基因檢測(cè)成為重要組成部分，其次還應(yīng)常規(guī)檢測(cè)干細(xì)胞供體有無(wú)急慢性傳染病，必要時(shí)檢測(cè)供體HLA類型。

遺傳性耳聾具有高度遺傳異質(zhì)性，目前多達(dá)70余種聽覺(jué)相關(guān)基因已被確定與非綜合征性或綜合征性耳聾相關(guān)(http://hereditaryhearingloss.org)。常規(guī)的基因芯片篩查可采用多重等位基因特異性PCR與通用芯片技術(shù)相結(jié)合技術(shù)(allele-specific PCR-based universal array，ASPUA，博奧生物公司)，但仍有大量考慮遺傳性耳聾的患者的遺傳致聾基因不明確。

隨著高通量序列捕獲方法和新一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）的發(fā)展，使得全外顯子組測(cè)序（Whole exome sequencing，WES）在闡述孟德爾遺傳疾病新的遺傳基礎(chǔ)和具有遺傳異質(zhì)性特征疾病的遺傳基礎(chǔ)具有技術(shù)可行性和高效能特征[9]。靶向的或者全外顯子組測(cè)序被證實(shí)是目前尋找非綜合征及綜合征性耳聾最強(qiáng)有力的方法，特別是在具有顯現(xiàn)特定耳聾表達(dá)，但因規(guī)模過(guò)小不能連鎖定位的小家系而言尤為有效。

1.1 全外顯子組測(cè)序

（1）根據(jù)制造商標(biāo)準(zhǔn)流程，使用SureSelet人類全外顯子組50Mb試劑盒進(jìn)行溶液雜交選擇方法對(duì)編碼外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子富含區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)綁定Illumina Hiseq2000適配序列，DNA富含樣本被高通量的Hiseq2000儀器測(cè)序分析。

（2）測(cè)序后產(chǎn)生的大量遺傳數(shù)據(jù)通過(guò)Bur?rows-Wheeler Aligner(BWA),Genome Analysis Tool?kit(GATK)，和SeattleSeq等軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)處理分析。

（3）定位讀取、變異體檢測(cè)、數(shù)據(jù)過(guò)濾分析和注解在之前的報(bào)道中有所注解[9]。

2 BMSC的制備和鑒定

骨髓中BMSC含量極少，僅占骨髓單核細(xì)胞的0.002%-0.005%[10]，因此制定BMSC體外培養(yǎng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，因從細(xì)胞類型、純度、活性及功能進(jìn)行評(píng)估，而分類鑒定是建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，目前比較通用的是國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）對(duì)MSC的三條最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)[11]：①塑料粘附性，即在培養(yǎng)瓶中細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；②表達(dá)標(biāo)志為CD14-或CD11b-，CD19-或CD79+，CD34-，CD45-，HLA-DR-，CD73+，CD90+，CD05+；③具有多向分化潛能，即在體外可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨母細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。其中流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型是檢測(cè)重點(diǎn)，不僅應(yīng)檢測(cè)分離后細(xì)胞表型，還應(yīng)對(duì)細(xì)胞傳代后表型穩(wěn)定性進(jìn)行研究[12]。

2.1 BMSC制備

（1）4周齡SD大鼠處死消毒后，取其雙側(cè)股骨和脛骨，用DMEM沖洗骨髓，收集沖洗液。

（2）將骨髓沖洗液緩慢加入密度為1.077g/m l的Ficoll分離液中，離心后用巴氏吸管取出單核細(xì)胞層，PBS洗滌細(xì)胞2次。

（3）用含10%胎牛血清的低糖DMEM重懸細(xì)胞，以1.0×105cell/ml接種于T25培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5%CO2環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔兩天換培養(yǎng)液。

2.2 BMSC鑒定

2.2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

（1）將細(xì)胞消化后懸浮細(xì)胞，分批次加入抗MSC表面標(biāo)志物抗體，冰上孵育30分鐘后，PBS洗滌3次[4]。

（2）用4%多聚甲醛固定10分鐘，PBS洗滌3次后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.2.2 體外誘導(dǎo)BMSC向成骨成脂分化及茜素紅和油紅O染色

（1）將細(xì)胞消化后懸浮細(xì)胞，以0.5×104cell/m l密度接種至培養(yǎng)皿。

（2）3天后培養(yǎng)基改為骨分化試劑盒、脂肪分化試劑盒（美國(guó)Gibco公司），每3-4天換液一次，持續(xù)培養(yǎng)2周。

（3）分化后細(xì)胞用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定30分鐘。

（4）分別用茜素紅染色骨分化細(xì)胞、油紅O染色脂肪分化細(xì)胞，PBS漂洗后吸凈殘余液體，顯微鏡下觀察。

3 BMSC凍存及復(fù)蘇

干細(xì)胞在低于-80℃的超低溫條件下，內(nèi)部的生化反應(yīng)變慢，而在低于-196℃（液氮）時(shí)，生化反應(yīng)幾乎終止。而將凍存的干細(xì)胞快速恢復(fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)。冷凍保護(hù)劑能與溶液中的水分子結(jié)合，能降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成；還可以通過(guò)其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受高溶質(zhì)損傷。在細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，此時(shí)干細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多冰晶，而且干細(xì)胞在高濃度電解質(zhì)溶液中時(shí)間很短。最常用的滲透性凍存保護(hù)劑為二甲基亞砜（DMSO），但其不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰而且常溫下對(duì)細(xì)胞毒性較大，所以需要一定時(shí)間預(yù)冷，復(fù)蘇時(shí)也應(yīng)及時(shí)洗滌細(xì)胞。傳統(tǒng)凍存方式逐步降溫操作繁瑣，每一步操作對(duì)干細(xì)胞的復(fù)蘇率有著極大的影響。本課題組推薦運(yùn)用無(wú)蛋白非程序凍存液對(duì)BMSCs進(jìn)行凍存復(fù)蘇。該方法將傳統(tǒng)凍存方式逐步降溫方式優(yōu)化為一步降溫，減少細(xì)胞污染機(jī)會(huì)，同時(shí)無(wú)任何外源蛋白成分，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展[13]。

3.1 BMSC凍存

（1）將細(xì)胞消化后PBS洗滌2次，沉淀至離心管內(nèi)。

（2）加入適量CELLBANKER2無(wú)血清型細(xì)胞凍存液，以5×105-6cell/ml細(xì)胞濃度制成細(xì)胞懸液。

（3）將細(xì)胞懸液分裝于注明信息的凍存管中，纏繞封口膜。

（4）直接將凍存管放入-80℃冰箱，隔夜后放置于-196℃液氮中。

3.2 BMSC復(fù)蘇

（1）從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，立即置于37℃震蕩水浴箱中，快速晃動(dòng)溶解。

（2）待凍存管中細(xì)胞懸液溶解后，加入細(xì)胞培養(yǎng)基離心洗滌3次。

（3）加入適量的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，以1×105cell/ m l細(xì)胞濃度接種至T25培養(yǎng)瓶中，隔天更換培養(yǎng)基。

4 BMSC向螺旋神經(jīng)元樣細(xì)胞分化和鑒定

目前BMSC向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化主要包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)，共培養(yǎng)誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)等方法[14]。內(nèi)耳在發(fā)育過(guò)程中需要產(chǎn)生各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及相關(guān)蛋白包括骨形成蛋白-4（BMP4）、音猬因子（SHH）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3（NT-3）等，它們不僅能激活信號(hào)通路，調(diào)控相關(guān)基因，誘導(dǎo)關(guān)鍵蛋白合成，使干細(xì)胞向感覺(jué)神經(jīng)終末細(xì)胞發(fā)育，而且對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞的維持生長(zhǎng)具有重要作用[15]。而間接（非接觸）共培養(yǎng)體系模擬了移植進(jìn)內(nèi)耳的BMSC被基底膜和螺旋神經(jīng)元分隔的狀態(tài)，但允許各種因子從一側(cè)自由擴(kuò)散到另一側(cè)，細(xì)胞之間的物質(zhì)交流可能促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育。通過(guò)對(duì)比各種誘導(dǎo)方案，目前認(rèn)為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及共培養(yǎng)誘導(dǎo)方案排斥反應(yīng)及成瘤性更小，是更適合臨床應(yīng)用的推薦方案[16]。

4.1 BMSC向螺旋神經(jīng)元樣細(xì)胞分化

4.1.1 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)

（1）用多聚賴氨酸（0.1mg/ml）鋪被于培養(yǎng)皿上，室溫過(guò)夜后PBS漂洗3次。

（2）將細(xì)胞消化后接種于鋪被好的培養(yǎng)皿中。

（3）2天后更換培養(yǎng)基為內(nèi)耳神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)液（包含音猬因子及全反式維甲酸）[4]，2-3天換液一次。

（4）持續(xù)培養(yǎng)6天后培養(yǎng)基換為感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)液（含BMP4），2-3天換液一次，持續(xù)培養(yǎng)6天后鑒定檢測(cè)。

4.1.2 耳蝸基底膜共培養(yǎng)誘導(dǎo)

（1）將鼠尾膠原蛋白溶液與10×Eagle培養(yǎng)基、2%碳酸鈉以9:1:1的比例預(yù)先充分混合，取15微升的混合液放置于培養(yǎng)皿中心，放置10分鐘，然后加入1m l基底膜混合培養(yǎng)溶液（1%無(wú)血清BME，1% FBS，2mM谷氨酰胺，5mg／ml葡萄糖，10U／m l青霉素）。

（2）將出生3天的SD大鼠酒精消毒后迅速斷頭，聽泡放置于PBS溶液中，將基底膜組織解剖出來(lái)：用游絲鑷去除聽泡外層的骨殼，再小心剝除耳蝸外層的蝸殼，顯露出其內(nèi)部的膜迷路結(jié)構(gòu)，繼續(xù)去除耳蝸的螺旋韌帶和血管紋組織，從底轉(zhuǎn)開始沿蝸軸與基底膜相連接出斷開，自底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)仔細(xì)分離，直至基底膜與蝸軸完全分開。將耳蝸基底膜組織轉(zhuǎn)移到粘附于培養(yǎng)皿底、浸泡于無(wú)血清培養(yǎng)基的鼠尾膠滴上，注意分辨清楚基底膜的前庭膜面朝上，將培養(yǎng)皿放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，12小時(shí)后換為含有5%FBS的培養(yǎng)基。

（3）傳代第三代的BMSC，以1.0×105的密度接種于下層培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞貼壁。將鼠尾膠滴連同其上培養(yǎng)的耳蝸基底膜組織一起取下，置于Transwell培養(yǎng)室的上層培養(yǎng)皿中，行間接共培養(yǎng)每48小時(shí)換一次液，共培養(yǎng)2周。

4.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞鑒定

由于SGNs缺乏特異性的分子標(biāo)志物，目前無(wú)法通過(guò)單一的表面蛋白準(zhǔn)確鑒定SGNs，目前國(guó)際上比較推薦檢測(cè)神經(jīng)元相關(guān)蛋白及基因包括Tuj1、MAP2、Neurog1、NeuroD、NF-M等[4,14,15]。SGNs既接受毛細(xì)胞釋放的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)（谷氨酸）對(duì)它的興奮作用，同時(shí)也接受來(lái)自于傳出神經(jīng)系統(tǒng)橄欖耳蝸束傳出神經(jīng)的傳出末梢釋放的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)（γ-氨基丁酸，GABA）對(duì)它的抑制性調(diào)節(jié)，通過(guò)檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞谷氨酸受體（GluR2/3）和GABA受體（GABARAP）也可以分析神經(jīng)遞質(zhì)類型。此外通過(guò)膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的動(dòng)作電位，電壓依賴性鈉、鉀、鈣通道及FM1-43吞吐功能（突觸功能），可以在功能上進(jìn)一步鑒定。綜上，本研究小組推薦從細(xì)胞雙極形態(tài)、蛋白表達(dá)水平、神經(jīng)遞質(zhì)類型、電生理檢測(cè)上多方面鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞。

4.2.1 神經(jīng)遞質(zhì)類型及螺旋神經(jīng)節(jié)相關(guān)蛋白免疫熒光檢測(cè)

（1）細(xì)胞玻片用4%的多聚甲醛固定30分鐘，PBS溶液漂洗3次。

（2）0.25%Triton X-100破膜30分鐘，PBS溶液漂洗3次。

（3）吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加10%正常山羊血清和1%牛血清白蛋白，室溫封閉30分鐘。

（4）吸水紙輕柔吸掉封閉液，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過(guò)夜。一抗：兔抗-Tuj1(β-tubulinⅢ,abcam,1:500),鼠抗-MAP2(Sigma,1:500),兔抗-GluR2/3(Abgent,1: 500)，兔抗-GABARAP(Sigma,1:300)。

（5）加熒光二抗：PBS溶液洗3次后吸干標(biāo)本上液體，滴加相應(yīng)熒光二抗，37℃濕盒中孵育1小時(shí)。

（6）染核：滴加DAPI避光孵育5分鐘，PBS溶液洗3次，每次5分鐘。

（7）吸凈標(biāo)本上液體，封片膠封閉標(biāo)本，激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss LSM 780）采集圖像。

4.2.2 RT-PCR

為了研究誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)的基因是否與SGNs相同，采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)來(lái)檢測(cè)SGNs相關(guān)基因（NeuroD,Neurog1,NF-M）在誘導(dǎo)后細(xì)胞的表達(dá)情況。

分別取誘導(dǎo)后細(xì)胞、SGNs、BMSC-GFP三種細(xì)胞，加入Trizol(Invitrogen)提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值，判斷RNA純度和質(zhì)量。取RNA吸光度在1.9-2.0之間的樣本進(jìn)行cD?NA的合成。使用SuperscriptⅢ(Invitrogen)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行cDNA的合成。

4.2.3 電生理檢測(cè)

兩步法拉制玻璃微電極，電極尖端直徑0.5-1μm，充灌電極內(nèi)液后電阻為1-3MΩ。將培養(yǎng)有誘導(dǎo)后細(xì)胞的玻片置于浴槽中，選擇折光性好，邊緣光滑、細(xì)胞體較大的細(xì)胞進(jìn)行記錄。用細(xì)胞外液以1ml/min恒速灌流，調(diào)節(jié)微操縱儀，使電極尖端與細(xì)胞膜接觸，形成高阻封接（>1MΩ）后采用真空抽吸的方法破膜。在電壓鉗模式下，記錄Na+電流和K+電流；電流鉗模式下，記錄動(dòng)作電位。浴液成分為（mM）：120 NaCl,30 glucose,25 HEPES,5 KCl, 2 CaCl2,1MgCl2,用NaOH調(diào)PH值為7.3，滲透壓為297mOsm。電極內(nèi)液成分為(mM)：147 KCl,5 Na-phosphocreatine,2 EGTA,10 HEPES,4 MgATP, and 0.5 Na2GTP,用KOH調(diào)PH值為7.3，滲透壓為300mOsm。

5 耳聾模型

烏本苷（Ouabain）是一種常見的強(qiáng)心苷，可以選擇性與Na+-K+-ATP酶相結(jié)合，并抑制其活性。在沙鼠的圓窗膜處置入烏本苷溶液，可引起螺旋神經(jīng)元的大量凋亡，同時(shí)毛細(xì)胞的形態(tài)和功能均未受到明顯的影響[17]。這種聽神經(jīng)病動(dòng)物模型可用于細(xì)胞移植相關(guān)治療的實(shí)驗(yàn)研究，從而引起很多研究者的極大興趣，是目前比較成熟且確切的神經(jīng)性耳聾的造模藥物，可通過(guò)耳蝸切片及聽力檢測(cè)來(lái)檢測(cè)造模效果。

5.1 烏本苷?qǐng)A窗給藥手術(shù)

（1）動(dòng)物麻醉后俯臥位，清理術(shù)區(qū)消毒后，沿耳廓后緣做長(zhǎng)約1cm的切口。在手術(shù)顯微鏡下用解剖鑷分離皮下和肌肉組織，暴露聽泡外的蜂窩樣骨質(zhì)，用電鉆打開聽泡，顯露圓窗和圓窗膜。

（2）用微量注射器取10微升的Ouabain溶液10mM，顯微鏡下小心的置于圓窗膜上，保持動(dòng)物體位固定不動(dòng)15分鐘后縫合關(guān)閉傷口。

（3）手術(shù)后將動(dòng)物置于保溫墊上，保持體溫醒麻醉，肌肉注射青霉素80單位;手術(shù)后兩小時(shí)行ABR測(cè)聽。

5.2 耳蝸取材及HE染色

（1）用足量戊巴比妥鈉溶液將動(dòng)物麻醉后，斷頭處死。完整的取出聽泡，解剖分離出耳蝸，自蝸尖開窗，打開圓窗膜，對(duì)耳蝸進(jìn)行4%多聚甲醛灌洗固定，置于4℃冰箱中固定24小時(shí)。

（2）固定后的耳蝸進(jìn)行石蠟包埋和切片，行免疫組化染色觀察：沿下列順序進(jìn)行，酒精濃度70%（過(guò)夜）—80%（2小時(shí)）—90%（2小時(shí)）—95%（2小時(shí)）—100%（2小時(shí)）—二甲苯（2小時(shí)）。

（3）將耳蝸組織置于液態(tài)石蠟中浸蠟1小時(shí)。將浸好蠟的組織倒入石蠟將組織塊包埋。待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。進(jìn)行石蠟組織塊切片，并進(jìn)行HE染色。

6 BMSC內(nèi)耳移植途徑和細(xì)胞濃度

BMSC的內(nèi)耳移植途徑主要包括經(jīng)鼓階的外淋巴系統(tǒng)移植、經(jīng)中階的內(nèi)淋巴系統(tǒng)移植、蝸軸和聽神經(jīng)干徑路移植。鼓階途徑是將干細(xì)胞植入外淋巴，移植空間大，流動(dòng)的外淋巴液有利于移植細(xì)胞的遷移及分布，并且鼓階處的開窗對(duì)神經(jīng)的損傷小，術(shù)后聽力影響不大。因此，多數(shù)干細(xì)胞內(nèi)耳移植的研究，都采用了鼓階外淋巴系統(tǒng)移植。有學(xué)者比較了豚鼠空白對(duì)照組、單純耳蝸造孔組及BMSC經(jīng)耳蝸造孔移植組的術(shù)后聽力改變，證實(shí)了鼓階開窗行BMSC移植手術(shù)對(duì)動(dòng)物的聽力及耳蝸形態(tài)學(xué)影響是輕微的，移植后干細(xì)胞能在耳蝸內(nèi)遷移、存活[18]。Kamiya等在急性聽力損失的鼠模型中，經(jīng)外半規(guī)管植入干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞能在某些趨化因子的作用下遷徙到耳蝸外側(cè)壁損傷部位，并且損傷部位的細(xì)胞數(shù)明顯高于非損傷部位[19]。

對(duì)于建立較規(guī)范的間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)耳移植的標(biāo)準(zhǔn)而言，除了要明確不同的移植途徑對(duì)移植細(xì)胞分布的影響，還要選擇一個(gè)合適的移植數(shù)目。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)移植細(xì)胞數(shù)目并未達(dá)成共識(shí)，多集中在104~107個(gè)/ml。細(xì)胞植入后既要產(chǎn)生一定預(yù)期的生物學(xué)功能，又不能對(duì)聽力造成過(guò)多的損失。本研究小組對(duì)不同濃度干細(xì)胞移植經(jīng)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)105個(gè)/m l細(xì)胞濃度的植入對(duì)聽力損傷最小，而且2周后存活細(xì)胞較多。

6.1 鼓階途徑內(nèi)耳移植

（1）動(dòng)物麻醉后俯臥位，清理術(shù)區(qū)消毒后，沿耳廓后緣做長(zhǎng)約1cm的切口。在手術(shù)顯微鏡下用解剖鑷分離皮下和肌肉組織，暴露聽泡外的蜂窩樣骨質(zhì)，用電鉆打開聽泡，顯露鐙骨肌動(dòng)脈、圓窗龕及耳蝸底轉(zhuǎn)靠近鐙骨肌動(dòng)脈的部分;

（2）用微鉆在鼓階外側(cè)壁造孔，引流部分外淋巴液;

（3）用微量注射器取105個(gè)/m l細(xì)胞懸液10ul，顯微鏡下緩慢注入鼓階。

（4）骨蠟封閉鼓階后，縫合術(shù)腔。

7 BMSC內(nèi)耳移植安全性

建立BMSC內(nèi)耳移植的安全性質(zhì)量規(guī)范包括毒理試驗(yàn)，外源因子檢測(cè)以及干細(xì)胞移植后動(dòng)物耳蝸長(zhǎng)期觀察。毒理實(shí)驗(yàn)依據(jù)《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》，對(duì)體外誘導(dǎo)分化后的干細(xì)胞進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。外源因子檢測(cè)規(guī)范，按2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》，運(yùn)用相關(guān)檢測(cè)試劑盒對(duì)體外誘導(dǎo)分化的干細(xì)胞進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)、病毒因子檢測(cè)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)、外源細(xì)胞因子檢測(cè)分析。

有關(guān)耳蝸的形態(tài)學(xué)研究目前主要依靠通過(guò)耳蝸組織的冰凍切片或者石蠟切片和基底膜鋪片后，用顯微鏡進(jìn)行觀察，但切片的過(guò)程破壞了標(biāo)本的原始性，易生成偽像。本研究小組推薦應(yīng)用Micro-CT對(duì)移植后動(dòng)物耳蝸進(jìn)行安全性檢測(cè)，優(yōu)勢(shì)在于能對(duì)動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間活體連續(xù)觀察。Micro-CT擁有超高清的分辨率，并引進(jìn)了圓錐形光束運(yùn)算法則，提高了非侵入性的小動(dòng)物成像研究專用掃描儀器的實(shí)用性。另外，引進(jìn)了提升軟組織對(duì)比度的新型增強(qiáng)劑之后，Micro-CT已經(jīng)可以應(yīng)用于臨床前研究的體內(nèi)試驗(yàn)，來(lái)研究觀察軟組織結(jié)構(gòu)和血管形態(tài)。該技術(shù)已可應(yīng)用到耳科學(xué)的基礎(chǔ)研究和藥物實(shí)驗(yàn)中，可觀察耳部的鼓膜、聽骨鏈、耳蝸、半規(guī)管等精細(xì)結(jié)構(gòu)[20]。

8 BMSC內(nèi)耳移植有效性

目前內(nèi)耳移植有效性的研究主要聚焦在兩個(gè)層面，一是干細(xì)胞移植后能否到達(dá)SGN聚集區(qū)域包括基底膜、羅氏管和蝸軸區(qū)域，并且能與毛細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系，需要通過(guò)耳蝸切片熒光染色來(lái)確定；二是聽力功能恢復(fù)的直接證據(jù)，通過(guò)聽性腦干反應(yīng)（ABR）和耳聲發(fā)射（DPOAE）來(lái)檢測(cè)。

8.1 耳蝸切片免疫熒光染色

（1）耳蝸冰凍切片用5%的山羊血清浸泡封閉1小時(shí)后，PBS溶液漂洗。

（2）加入鼠來(lái)源一抗β-Tubulin III（1：200），4℃環(huán)境中孵育12小時(shí)后PBS溶液漂洗3次。

（3）加入相應(yīng)熒光二抗避光環(huán)境中，常溫下孵育1小時(shí)后PBS溶液漂洗3次。

（4）吸凈標(biāo)本上液體，封片膠封閉標(biāo)本，激光共聚焦掃描顯微鏡采集圖像。

（5）螺旋神經(jīng)元計(jì)數(shù)：取連續(xù)耳蝸中軸斷面的組織切片，每個(gè)耳蝸選取相應(yīng)的螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域作為螺旋神經(jīng)元的計(jì)數(shù)區(qū)域（細(xì)胞數(shù)/mm2）。螺旋神經(jīng)元用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物β-Tubulin III抗體進(jìn)行免疫熒光染色標(biāo)記，陽(yáng)性細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞。為了避免在計(jì)數(shù)過(guò)程中的偏差，我們根據(jù)Lang等[21]人的方法使用Abercromie校正因子來(lái)減少技術(shù)偏差。

8.2 聽功能檢測(cè)

分別于移植前、移植后1周、2周、3周、4周檢測(cè)動(dòng)物聽功能。聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）閾值測(cè)試采用美國(guó)TDT系統(tǒng)（Tuck?er-Davis Technologies hardware and software,TDT System III）。按如下步驟進(jìn)行ABR和DPOAE:

（1）動(dòng)物麻醉后，在隔聲屏蔽室將參考電極置于測(cè)試耳耳后，記錄電極置于顱頂正中，接地電極置于測(cè)試耳對(duì)側(cè)耳后。

（2）刺激聲為短聲、短純音4kHz、8kHz、16kHz、32kHz，設(shè)置聲刺激持續(xù)時(shí)間為10ms,帶通濾波寬度設(shè)置為300-3000HZ，疊加次數(shù)為1024次。

（3）最大刺激聲強(qiáng)度為l00dB SPL，每隔l0dB SPL遞減，以能分辨出可重復(fù)的ABR波I的最低刺激強(qiáng)度判斷閾值。在每個(gè)頻率的90dB SPL，測(cè)量ABR波I的潛伏期與振幅。

（4）DPOAE探頭密封于動(dòng)物外耳道內(nèi)，原始純音頻率比f(wàn)2/f1為1.2，L2/L1=60/65 dB。

9 總結(jié)

感音神經(jīng)性聾特別是神經(jīng)性耳聾的治療一直是耳科醫(yī)生十分棘手的問(wèn)題，干細(xì)胞的出現(xiàn)為其治療帶來(lái)了一線新的曙光。經(jīng)過(guò)學(xué)者們多年的研究，對(duì)于BMSC在感音神經(jīng)性耳聾治療方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，然而關(guān)于干細(xì)胞采集、純化、誘導(dǎo)等制備技術(shù)和移植后安全性有效性的評(píng)價(jià)都未形成一套比較成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程體系，因此無(wú)法真正將BMSC應(yīng)用于臨床治療。本文是對(duì)BMSC治療感音神經(jīng)性耳聾的技術(shù)方法和質(zhì)量控制措施建立的一次嘗試，為最終臨床安全和系統(tǒng)的運(yùn)用干細(xì)胞治療耳聾提供依據(jù)。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，相信不久的將來(lái)能在臨床上成為治療感音神經(jīng)性耳聾的有效手段。

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BoneM arrow M esenchymalStem Cells in The Treatmentof SensorineuralHearing Loss:A Summary of The Related Technical System s

PENGTao1，GAOShuichao1，ZHOUYuan1，QIN Jie1，XU Juan1，ZHUGanghua1，YANGShiming2，XIEDinghua1
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,Second Xiangya HospitalofCentralSouth University,Instituteof Otology ofCentral South University,Changsha,410011
2 DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,PLAGeneralHospital,Beijing,100853

XIEDinghua Email:dhuaxie@163.com

Sensorineural hearing loss(SNHL)can be caused by lesions of inner ear sensory cells.Treatment of SNHL remainsa challenge for clinicians.A new treatment for SNHL is the repair and regeneration of inner ear sensory cellsusing stem cells.Numerousadvances currently have been achieved in thisarea.Because of their low immunogenicity and easy accessibility,mesenchymal stromal cells(MSCs)have recently been considered as one of potentially ideal alternatives to restore degenerated inner ear sensory cells.However,research methods vary among research groups, from preparation to transplantation of stem cells,and no standardized process is established yet.This article focuses on the progress by Ding-hua Xie’s group in treating SNHL and describes the latestadvancesworldw ide.The paper aims to establish prelim inary standards for stem cells preparation and quality control for treatmentof SNHL,and to provide theoreticalevidence for clinical treatmentof SNHL using stem cells.

BoneMarrow Mesenchymal Stem Cells;SensorineuralHearing Loss；Technical System

R764

A

1672-2922（2017）03-350-7

2016-11-21審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.015

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）:2012CB967900和2012CB967904；中南大學(xué)博士生自主創(chuàng)新項(xiàng)目：2016zzts139

彭韜，博士研究生在讀，研究方向:干細(xì)胞

謝鼎華，Email:dhuaxie@163.com