李矛 趙彥濤 侯樹勛

大鼠顱骨骨缺損模型的建立及相關(guān)應(yīng)用

李矛 趙彥濤 侯樹勛

大鼠；顱骨；骨缺損；組織工程

骨組織工程研究中，針對骨修復(fù)材料在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估與檢測，首先需要通過動物實(shí)驗(yàn)得到相關(guān)的數(shù)據(jù)和結(jié)果[1-3]。O’Loughlin 等[4]在 2008年回顧近 10年 6種主要骨科雜志刊發(fā)的關(guān)于骨修復(fù)材料在動物模型評價(jià)資料發(fā)現(xiàn)：模型中，動物選擇的頻率分別為：大鼠 38%；兔子19%；小鼠 13%；羊 11%；狗 9%，山羊 4%；其它 4%。大鼠動物模型具有可重復(fù)性強(qiáng)、適宜于多種不同種類和類型材料的應(yīng)用評估、經(jīng)濟(jì)性價(jià)比高、學(xué)習(xí)曲線較短等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于骨組織工程中。與大動物模型相比，大鼠更易于飼養(yǎng)，社會關(guān)注度也較少[5]。大鼠顱骨與其它的骨骼組織相比，血運(yùn)較差，一旦發(fā)生缺損后自我修復(fù)能力較差，而且顱骨骨組織便于建立統(tǒng)一、可重復(fù)性強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)化缺損，比較容易應(yīng)用影像學(xué)和組織學(xué)方法進(jìn)行分析比較；顱骨骨組織的解剖結(jié)構(gòu)便于進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)的手術(shù)操作和術(shù)中的處理；顱骨下方的硬腦膜和其上的軟組織可以為植入材料提供很好的支持，不需要對植入材料和缺損的骨組織進(jìn)行固定[6-10]?，F(xiàn)就大鼠顱骨缺損模型的相關(guān)應(yīng)用報(bào)告如下。

一、大鼠顱骨缺損模型建立

Freeman 和 Turnbull[11]在 1973年首先描述了大鼠顱骨骨缺損的動物模型，選取實(shí)驗(yàn)動物為 15只，體重約 500g的中年 Wistar-Strain 大鼠。在其顱骨矢狀縫左右兩側(cè)的頂骨區(qū)域分別鉆取直徑 2mm 的骨組織缺損進(jìn)行修復(fù)材料的評估實(shí)驗(yàn)。目前，研究者在進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)時(shí)，多利用低速環(huán)形鉆頭在大鼠顱骨骨組織表面制造圓形的缺損。通常選取成年雄性大鼠，鹽酸氯胺酮 ( 40mg / kg ) 與鹽酸甲苯噻嗪 ( 8mg / kg ) 聯(lián)合麻醉，也有采用 10% 水合氯醛( 4ml / kg ) 腹腔注射麻醉[12]。大鼠頭顱備皮、消毒鋪巾后，從鼻骨開始，沿顱骨矢狀線取縱行手術(shù)切口，長約1.5～3cm，逐層分離軟組織，充分顯露矢狀縫、雙側(cè)頂骨及部分額骨和枕骨。根據(jù)圓形缺損直徑大小的不同，在不同部位進(jìn)行鉆孔建模，直徑≤6mm 一般在雙側(cè)頂骨處鉆孔；直徑＞6mm 一般以矢狀縫為中心進(jìn)行鉆孔。鉆孔前需將骨膜充分剝離，將不同直徑的空心鉆頭連接電鉆后，低速 ( ≤1500rpm ) 鉆取，鉆取過程中助手用生理鹽水滴注 ( 1滴 / 2s ) 降溫。鉆取時(shí)動作需輕柔 ( 單純憑借電鉆的自然重力，盡量不附加外力 )，避免將骨組織完全鉆穿，接近鉆穿時(shí)用剝離器沿著圓形缺損周邊進(jìn)行鈍性分離，從而避免硬腦膜及其下方的血管、腦組織的損傷。生理鹽水沖洗術(shù)野，探查無活動性出血后，用 0號線逐層關(guān)閉皮下組織、皮膚切口。術(shù)后大鼠側(cè)臥于 30℃ 恒溫臺進(jìn)行麻醉復(fù)蘇，完全清醒后送回飼養(yǎng)籠繼續(xù)喂養(yǎng)，于術(shù)后 8～12h，20～24h，32～36h 分別予以丁丙諾啡 ( 0.05mg / kg )腹腔注射鎮(zhèn)痛[13-15]。

二、大鼠顱骨缺損模型的相關(guān)影響因素

目前有關(guān)大鼠顱骨骨缺損模型建立的相關(guān)研究中，研究人員對臨界骨缺損 ( the critical size defects，CSD ) 大小的選擇、顱骨中央?yún)^(qū)域的單一缺損還是在雙側(cè)頂骨區(qū)域分布建立骨缺損、硬腦膜和骨膜是否進(jìn)行屏蔽處理等問題都存在廣泛的爭議。在大鼠種系、性別、年齡等選擇也都有不同的觀點(diǎn)。

1. 大鼠種系、年齡及性別的選擇：實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)根據(jù)研究目的及實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行選擇，一切用于研究的實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)具備遺傳性能的穩(wěn)定性，個(gè)體的均一性和比較容易得到、容易飼養(yǎng)等基本要求[16]。大鼠的種系一般選擇 Sprague Dawley ( SD ) 大鼠和 Wistar 大鼠，這兩個(gè)品種的大鼠生長較快、繁殖能力強(qiáng)，容易飼養(yǎng)，對傳染病的抵抗力較強(qiáng)。其中，SD 大鼠較 Wistar 大鼠更為溫順，更容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作而更受研究者歡迎。大鼠的年齡和雌激素都對骨缺損組織修復(fù)能力有影響，為避免對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生干擾，研究者通常采用成年的雄性大鼠進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，SD 大鼠一般＞12周 ( 體重 300～350g )[17]。

2. CSD 的大小選擇：Schmitz 和 Hollinger[18-19]在 1986年報(bào)道指出，動物顱骨及頜面部的骨缺損能否完成自我修復(fù)和缺損面積的大小正相關(guān)，從而提出了 CSD 的概念。CSD 定義為動物體內(nèi)的骨組織缺損，在自然狀態(tài)下終生或在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)不能自行達(dá)到骨性愈合。在大鼠顱骨缺損模型中，一般將圓形缺損的直徑用來描述和 CSD 的關(guān)系，其大小在應(yīng)用時(shí)具有一定的爭議，文獻(xiàn)報(bào)道的 CSD 從 2～8mm 不等，現(xiàn)在較多使用的 CSD 是 5mm 和 8mm。

Bosch 等[20]認(rèn)為：大鼠顱骨缺損直徑為 5mm 時(shí)，除了在缺損邊緣處有少量的骨形成之外，直到術(shù)后 12個(gè)月都不能完成骨性修復(fù)。Ferreira 等[21]研究辛伐他汀在骨組織修復(fù)過程中的局部應(yīng)用時(shí)，使用了 3個(gè)月的雄性 Wistar大鼠 ( 280～300g ) 作為動物實(shí)驗(yàn)的模型，其 CSD 為5mm。術(shù)后 30天和 60天的掃描電鏡、HE 染色以及一系列免疫組化染色的結(jié)果提示：在大鼠顱骨骨缺損處，辛伐他汀通過包含于微球中的局部釋放作用，可以明顯提高骨缺損處新骨形成量以及骨組織的礦化。Florczyk 等[22]在研究多孔殼聚糖－藻酸鹽支架在顱骨缺損修復(fù)應(yīng)用時(shí)，使用的動物模型為 4周的雌性 SD 大鼠、CSD 為 5mm 的顱骨缺損。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多孔殼聚糖－藻酸鹽支架復(fù)合BMP-2與單純支架、支架復(fù)合 BMSc 相比，其新骨形成量和骨組織的礦化程度都要明顯提高。Petridis 等[23]在用人牙髓干細(xì)胞復(fù)合到細(xì)胞外基質(zhì)支架，然后用于修復(fù)大鼠顱骨骨缺損的研究中，其動物實(shí)驗(yàn)是 30只 4個(gè)月齡的雄性Wistar 大鼠，其中 14只大鼠是雙側(cè)建立缺損，16只是單側(cè)建立缺損，CSD 是 5mm，并且盡量保護(hù)硬腦膜不受損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示單純的空白對照組是在骨缺損的周邊只有少量的新骨生成，不能完成骨修復(fù)；復(fù)合人牙髓干細(xì)胞復(fù)合到細(xì)胞外基質(zhì)支架組的新骨量明顯增加，未完成完全修復(fù)，考慮和所選用的細(xì)胞支架降解過快有關(guān)。Annibali等[24]在使用 Micro-CT 和 PET 進(jìn)行定量分析人牙髓干細(xì)胞復(fù)合于可降解支架植入大鼠顱骨缺損模型后的骨修復(fù)時(shí)，大鼠顱骨缺損模型采用的是在大鼠矢狀縫雙側(cè)的左右頂骨分別用環(huán)鉆建立 2個(gè)直徑為 5mm 的圓形缺損。作者將大鼠分為兩組，每組使用不同的支架材料進(jìn)行植入。A 組的大鼠顱骨雙側(cè)兩個(gè)骨缺損分別植入無機(jī)牛骨顆粒 ( granular deproteinized bovine bone，GDPB ) 支架復(fù)合人牙髓干細(xì)胞( dental pulp stem cells，DPSCs ) 和單純 GDPB 支架；B 組則分別植入 β-磷酸鈣 ( Beta-tricalcium phosphate，β-TCP)支架復(fù)合 DPSCs 和單純 β-TCP 支架。在術(shù)后 2周、4周、8周、12周分別行 Micro-CT 和 PET 檢查，并利用分析軟件分析結(jié)果顯示 GDPB 復(fù)合 DPSCs 組與單純 GDPB 支架組都有比較好的骨再生，但兩者在標(biāo)準(zhǔn)化攝取值 ( standard uptake value，SUV ) 和骨密度值 ( bone mineral density，BMD ) 方面，前者比后者稍高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；β-TCP 支架復(fù)合 DPSCs 與否都在 4周時(shí)支架降解，在12周時(shí)有骨再生，但 SUV 和 BMD 都要明顯低于 GDPB 支架組。

研究人員采用 CSD 為 5mm 的理由是可以在大鼠顱骨矢狀縫的左右兩側(cè)，建立單個(gè)或者兩個(gè)骨缺損。這樣首先可以避免損傷矢狀縫，避免矢狀竇組織里的間充質(zhì)干細(xì)胞和具有成骨作用的相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)入缺損處，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[25]。而且由于在 1只大鼠顱骨上可以同時(shí)建立兩個(gè)骨缺損，兩者進(jìn)行自我對照研究的同時(shí)，也減少了動物的使用數(shù)量。缺點(diǎn)是大鼠顱骨雙側(cè)的兩個(gè)缺損，由于彼此存在的緣故，可以允許物質(zhì)在兩者之間進(jìn)行擴(kuò)散和交換，從而會在一定程度上相互影響兩個(gè)缺損處的修復(fù)和骨再生，對動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生一些干擾[26]。另一方面，因?yàn)檠芯咳藛T一般會潛意識地選取一個(gè)更加大的 CSD 來增加自己的實(shí)驗(yàn)難度，從而使實(shí)驗(yàn)所評估的修復(fù)材料成骨性能更具有說服力，因此很多研究人員采用 CSD 為 8mm 的大鼠顱骨缺損模型。

Herberg 等[27]為了探討不同劑量 SDF-1β 復(fù)合 BMP-2后的成骨效應(yīng)，將不同劑量的 SDF-1β 與 BMP-2復(fù)合至可吸收的明膠海綿支架上 ( absorbable collagen sponge，ACS )，然后用于修復(fù)大鼠顱骨骨缺損。動物實(shí)驗(yàn)中，作者使用了 172只 11～13周的雄性 SD 大鼠，利用環(huán)鉆在大鼠頭顱人字縫前方、矢狀縫的正上方制造一個(gè)直徑為8mm 的圓形缺損，并將不同劑量的 SDF-1β 復(fù)合 BMP-2的 ACS 支架材料植入缺損處，并在缺損的上方用圓頂狀的鈦微孔板進(jìn)行保護(hù)。術(shù)后 4周的 X 線和 Micro-CT、HE 染色等結(jié)果提示骨缺損的修復(fù)程度和 BMP-2的劑量正相關(guān)；選取一個(gè)較小的 BMP-2濃度 ( 0.5μg ) 和不同濃度的 SDF-1β 復(fù)合時(shí)，骨缺損的修復(fù)程度和 SDF-1β 的劑量正相關(guān)，而且和單純高劑量 BMP-2相比，差異沒有顯著性。Li 等[28]在進(jìn)行大鼠顱骨缺損修復(fù)的研究中，利用牛血清蛋白 ( BSA ) 納米顆粒包裹 BMP-2和地塞米松( DEX )，并溶解于聚己內(nèi)酯－聚乙二醇 ( PCE ) 溶液中，通過靜電紡絲技術(shù)制備成納米纖維支架，在支架上種植BMSc 細(xì)胞后，將其用于顱骨缺損處的原位修復(fù)。實(shí)驗(yàn)中，將 36只 SD 大鼠隨機(jī)分為 6組，每只大鼠顱骨缺損為直徑 8mm 圓形缺損。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在 4周時(shí)骨缺損邊緣開始有少量骨組織生成，在 12周時(shí)，BMP-2/ DEX 支架組修復(fù)的骨缺損面積為 ( 91.57±5.42) %，無任何支架的空白對照組無骨組織修復(fù)。

隨著骨組織修復(fù)過程中的問題和挑戰(zhàn)越來越多，盡管有一些比 CSD 要小的顱骨缺損模型也應(yīng)用于評估骨組織修復(fù)過程中的一些生理或者病理的條件和情況，以及一些硬組織相關(guān)手術(shù)操作的優(yōu)化，但是 CSD 為 5mm 或者8mm 還是被大多數(shù)研究者所共識[29-32]。

3. 硬腦膜和骨膜是否屏蔽處理：硬腦膜在顱骨缺損修復(fù)過程中起著非常重要的作用，其不僅是成骨細(xì)胞的一個(gè)來源中心，同時(shí)提供大量骨組織修復(fù)過程中具有骨誘導(dǎo)和成骨作用的細(xì)胞因子[33-34]。Denicolo 等[35]做了大量的實(shí)驗(yàn)，采用聚四氟乙烯膜 ( polytetrafluoroethylene，PTFE ) 物理性地將顱骨缺損邊緣的骨性結(jié)構(gòu)與硬腦膜、骨膜進(jìn)行隔離，從而阻止來自顱骨缺損邊緣的外周細(xì)胞參與到纖維膜性結(jié)構(gòu)與硬腦膜、骨膜之間的骨形成過程中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在骨膜和 PTFE 膜之間、PTFE 膜和硬腦膜之間有大量新骨生成，表明骨膜和硬腦膜具有骨誘導(dǎo)和促進(jìn)新骨形成的作用，而形成新生骨組織的前驅(qū)細(xì)胞，其增殖和分化都來源于骨膜和硬腦膜。Esther 等[36]在研究生物活性膜體外骨組織礦化和動物體內(nèi)骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，通過21只雄性 SD 大鼠 ( 12周齡，425～475g ) 的顱骨缺損模型觀察體內(nèi)骨缺損的修復(fù)情況，在大鼠顱骨矢狀縫右側(cè)的頂骨處，利用環(huán)形鉆頭制造一個(gè)直徑為 5mm 的圓形骨缺損，將不同種類的生物活性膜覆蓋于缺損表面。術(shù)后 7天的 Micro-CT 結(jié)果顯示，含有 HAP [[( VPGIG )2( VPGKG ) ( VPGIG )2]2DDEEKFLRRIGRFG [( VPGIG )2( VPGKG ) ( VPGIG )2]2]3。

這一氨基酸序列的生物活性膜組，其新骨的生產(chǎn)量明顯高于其它組。術(shù)后的 HE 染色以及 Masson 染色的結(jié)果也提示在生物活性膜的下方，在硬腦膜的上方有大量的新骨形成和骨組織的礦化。Honma 等[37]在關(guān)于大鼠顱骨缺損的不同 CSD 進(jìn)行骨修復(fù)的研究中也發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞的骨修復(fù)主要發(fā)生在硬腦膜和骨膜處，而不是缺損邊緣，認(rèn)為這主要是和成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞、相關(guān)的細(xì)胞因子主要來源于硬腦膜和骨膜。硬腦膜處的新骨生成更加的明顯，也說明了硬腦膜是促進(jìn)成骨的重要相關(guān)因素。而且，眾多的研究者在進(jìn)行建模操作時(shí)，都重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了動作需要輕柔，盡可能地避免硬腦膜在操作過程中受到損害。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)在動物實(shí)驗(yàn)中，理想的骨缺損模型應(yīng)包括以下幾個(gè)特點(diǎn)[13,27,38-40]：( 1) 高度可重復(fù)性；( 2)可用于多種不同類型材料的應(yīng)用評估與檢測；( 3) 盡可能與臨床實(shí)際情況相關(guān)聯(lián)；( 4) 可以應(yīng)用于多種不同的分析方法；( 5) 實(shí)驗(yàn)動物具有較低的患病率與病死率。除此之外，還有幾個(gè)因素需要考慮，例如動物模型建立的學(xué)習(xí)曲線、動物飼養(yǎng)條件的要求以及動物的經(jīng)濟(jì)性等。在骨組織工程研究過程中，很多的研究者都選用大鼠顱骨缺損模型作為動物實(shí)驗(yàn)對支架材料進(jìn)行評估。但是在模型的建立過程中，大家通常都會選擇成年雄性的 SD 大鼠做為實(shí)驗(yàn)動物。在 CSD 選擇 5mm 還是 8mm、建模時(shí)是選擇中央缺損還是雙側(cè)缺損、是否考慮矢狀縫的損傷、硬腦膜和骨膜是否進(jìn)行屏蔽等方面都存在爭議。動物模型的相關(guān)參數(shù)不能完全統(tǒng)一，必然會干擾不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的比較。為了在骨組織工程研究中能夠更加客觀地評估研究對象，則需要對這些相關(guān)的影響因素進(jìn)行一一明確，將動物模型標(biāo)準(zhǔn)化。

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( 本文編輯：裴艷宏 )

Establishment and relative applications of the rat calvarial bone defect model

LI Mao, ZHAO Yan-tao, HOU Shuxun.
Institute of Orthopedics, the fi rst aff i liated Hospital of the PLA General Hospital, Beijing, 100048, China Corresponding author: HOU Shu-xun, Email: hsxortho@hotmail.com

The rat calvarial bone defect model is widely applied in bone tissue engineering, especially in the animal model for bone grafting materials and relative cytokines. There are many disputes on the diameter size of the critical size defects ( CSD ), unilateral or bilateral defects, whether to shield the dura mater and pericranium during the process of establishing the rat calvarial bone defect model. Based on our literature review, there are many different disputes about the species, sex, and age of rats. We’ve conf i rmed that male adult ( 10- 12weeks, 300- 350g , Sprague Dawley / SD ) rats are preferred in the model establishment. When the CSD is 5mm, the researcher can make a selfcomparison and avoid the damage of the sagittal suture, thus reduce the number of rats with the bilateral defects at the same time. When the CSD is 8mm, a larger range of defects may be established, so as to make the experimental results more convincing. The dura mater and pericranium can promote the repair of calvarial bone defects as intramembranous bone growth sites. Therefore, we may consider shielding the dura mater and pericranium during the process of evaluating the bone repair materials and relative cytokines to avoid the interference on the results.

Rats; Skull; Bone defect; Tissue engineering

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.08.014

R683, R318

100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院、北京市骨科植入醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心、全軍骨科研究所( 李矛、趙彥濤、侯樹勛 )；100048 北京，解放軍第 306醫(yī)院 ( 李矛 )

侯樹勛，Email: hsxortho@hotmail.com

2016-07-15)