河北中醫(yī)學(xué)院

李杰茹 韓聚強(qiáng) 傅 天 李志麗 康立英 馬志紅 石 紅△(石家莊 050200)

方 藥 研 究

乳癖消顆粒對(duì)乳腺增生
大鼠抗氧化能力及雌孕激素比值的影響*

河北中醫(yī)學(xué)院

李杰茹 韓聚強(qiáng) 傅 天 李志麗 康立英 馬志紅 石 紅△(石家莊 050200)

目的：研究乳癖消顆粒對(duì)乳腺增生大鼠體內(nèi)抗氧化能力和雌孕激素的影響，為藥物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用雌、孕激素聯(lián)合造模制成大鼠乳腺增生模型，用藥后觀察各組大鼠乳頭外觀，檢測(cè)各組大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性及各組大鼠血清中丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)的含量，應(yīng)用放免法檢測(cè)血清中雌二醇(E2)和孕酮(P)的濃度，同時(shí)計(jì)算二者比值。結(jié)果：乳癖消3個(gè)劑量組均可明顯降低大鼠乳頭的高度和直徑(P<0.05)；高、中劑量組能顯著降低MDA和8-OhdG的含量，升高SOD和GSH-Px活性(P<0.05或P<0.01)；乳癖消各組均可降低血清中E2，提高P水平，改善二者比值。結(jié)論:乳癖消顆粒對(duì)乳腺增生大鼠有較好的治療作用，其治療機(jī)制可能與增強(qiáng)乳腺增生大鼠體內(nèi)抗氧化能力及調(diào)節(jié)雌孕激素，改善E2/P比值有關(guān)。

乳癖消；乳腺增生；他莫昔芬; 氧自由基；抗氧化力；E2/P；雌孕激素

乳腺增生是婦科的一種常見病，隨著生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)的改變，工作壓力的增大，發(fā)病率逐年上升且出現(xiàn)年輕化的的趨勢(shì)，已經(jīng)很大程度上影響了女性的生活質(zhì)量。乳癖消顆粒作為一副中成藥在臨床應(yīng)用中對(duì)乳腺增生癥的治療有良好的效果。[1-3]但確切的作用機(jī)制尚未完全清楚，本研究旨在通過(guò)復(fù)制大鼠乳腺增生模型，利用現(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)對(duì)中成藥乳癖消顆粒作用后大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)水平及雌二醇(E2)和孕酮(P)的濃度進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究乳癖消顆粒治療乳腺增生癥的治療機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 乳癖消顆粒(鹿角、蒲公英、昆布、天花粉、雞血藤、三七、赤芍、海藻、漏蘆、木香、玄參、牡丹皮、夏枯草、連翹、紅花等藥物組成，哈爾濱泰華藥業(yè)股份有限公司)含生藥量(6 g生藥/8 g)，苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司)，枸櫞酸他莫昔芬(蘇州第一制藥有限公司)，SOD測(cè)試盒、MDA測(cè)試盒和GSH-Px測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物研究所，8-OhdG試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物 62只雌性未孕 SD大鼠(體質(zhì)量180～220 g)購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：1405026，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠乳腺增生模型的建立 將62只雌性未孕SD大鼠，隨機(jī)選出10只作為正常對(duì)照組，肌注生理鹽水30 d；其余大鼠苯甲酸雌二醇注射液 0.5 mg/kg肌肉注射，1次/d，連續(xù)25 d，后改用黃體酮注射液 5 mg/kg，肌肉注射，連續(xù)5 d，30 d后在模型組隨機(jī)取2只大鼠處死，取其乳腺組織作病理切片觀察，確認(rèn)模型建立成功。模型復(fù)制成功后，將模型大鼠隨機(jī)分為5組，模型對(duì)照組、他莫昔芬組、乳癖消顆粒低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。

2.2 給藥方法 臨用前將乳癖消顆粒溶于蒸餾水配制成濃度分別為13 g/100 mL、26 g/100 mL和52 g/100 mL低、中、高劑量3種溶液。乳癖消顆粒各組按低、中、高劑量組分別灌胃1.3、2.6、5.2 g/kg，連續(xù)30 d，1次/d；陽(yáng)性對(duì)照組灌胃他莫昔芬，劑量為1.8 mg/kg，正常對(duì)照組、模型組灌服生理鹽水10 mL/只；1次/d，連續(xù)30 d。每周測(cè)量大鼠第2對(duì)乳頭高度1次。末次給藥后1 h，25%氨基甲酸乙酯4 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min低溫離心10 min，分離血清,4℃冰箱存放。

2.3 大鼠血清中氧化劑和抗氧化指標(biāo)的檢測(cè) 取血清分別按SOD、GSG-Px和MDA 試劑盒說(shuō)明書步驟操作，比色法測(cè)定吸光度(A)值，按公式計(jì)算出血清中各檢測(cè)指標(biāo)含量。血清中8-OhdG的水平采用ELISA法檢測(cè)，使用的是抗8-OhdG單克隆抗體。用微孔過(guò)濾器預(yù)處理血液樣本。每支試管加入 200 μL血清，1 500 r/min離心 30 min，取上清，加入一抗，在另一試管中加入樣本，平板震動(dòng)，4℃下孵育過(guò)夜。每支試管用250 μL 沖洗液沖洗3次，加入二抗，平板振動(dòng)，在室溫下孵育1 h。然后在每支試管中加入100 μL反應(yīng)中止液，平板振動(dòng)，平板顯示器上以450 nm 測(cè)量被吸收者。標(biāo)準(zhǔn)曲線用來(lái)計(jì)算樣本中 8-OhdG的量。

2.4 大鼠血清中雌孕激素的檢測(cè) 應(yīng)用放免法檢測(cè)血清中E2和P的濃度，同時(shí)計(jì)算二者比值。

3 治療結(jié)果

3.1 對(duì)各組大鼠乳頭高度及直徑的影響 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，乳腺增生模型組大鼠乳頭高度、乳頭直徑顯著增高(P<0.05 )；與乳腺增生模型組比較，乳癖消顆粒各劑量組大鼠乳頭高度、乳頭直徑均明顯偏小(P<0.05 ) ，詳見表1。提示乳癖消顆粒具有改善大鼠乳腺組織增生的功效。

組別n劑量乳頭高度(mm)乳頭直徑(mm)正常對(duì)照組102mL生理鹽水107±016 102±011 模型對(duì)照組102mL生理鹽水169±021?166±014?他莫昔芬組1018mg/kg133±020#115±015#乳癖消低劑量組1013g/kg148±034#146±021#乳癖消中劑量組1026g/kg136±029#131±015#乳癖消高劑量組1052g/kg132±020#124±032#

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05

3.2 乳腺增生大鼠體內(nèi)氧化及抗氧化指標(biāo)的變化 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，乳腺增生模型組大鼠血清中MDA和8-OhdG的含量明顯增高(P<0.01)；而SOD活性及GSH-Px活性則顯著降低(P<0.01)。詳見表2、表3。提示乳腺增生大鼠存在DNA損傷和組織過(guò)氧化損傷，且抗氧化能力降低。

3.3 乳癖消顆粒對(duì)乳腺增生大鼠血清中SOD 、GSH-Px酶活性及MDA和8-OhdG的含量的影響 與乳腺增生模型組大鼠對(duì)比，乳癖消高、中、低劑量組大鼠血清GSH-Px活性明顯增高(P<0.01)，血清MDA含量明顯降低(P<0.01)，乳癖消高、中劑量組大鼠血清SOD活性明顯增高(P<0.05)，血清8-OhdG的含量明顯降低(P<0.05)，低劑量組SOD及8-OhdG無(wú)明顯改變(P>0.05)；與他莫昔芬組比較,高劑量組大鼠血清中SOD 、GSH-Px、MDA和8-OhdG無(wú)明顯的變化(P>0.05)。詳見表2、表3。結(jié)果顯示:乳癖消顆粒具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA氧化損傷及清除自由基的作用。

組別n劑量SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)正常對(duì)照組102mL生理鹽水1721±1262 8729±1365 模型對(duì)照組102mL生理鹽水1345±1426??3833±1155??他莫昔芬組1018mg/kg1601±1276## 7903±2084##乳癖消低劑量組1013g/kg1317±1193 4301±1543##乳癖消中劑量組1026g/kg1601±1040## 5517±2048##乳癖消高劑量組1052g/kg1693±1426## 8285±2021##

注：與正常對(duì)照組比較，** P<0.01；與模型組對(duì)照組比較，## P<0.01

組別n劑量MDA(nmol/mL)8-OhdG(ng/mL)正常對(duì)照組102mL生理鹽水441±0546 1189±0383 模型對(duì)照組102mL生理鹽水1250±0648??1295±1010??他莫昔芬組1018mg/kg685±0678##1206±0775# 乳癖消低劑量組1013g/kg1118±0769##1273±1193 乳癖消中劑量組1026g/kg861±0561##1211±0673# 乳癖消高劑量組1052g/kg641±0554##1205±0789#

注：與正常對(duì)照組比較，** P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05,## P<0.01

3.4 乳腺增生大鼠中E2、P和E2/P的變化 與正常對(duì)照組比較，乳腺增生模型組大鼠血清中E2的含量明顯增高(P<0.01)，P的含量顯著降低(P<0.01)，E2/P比值明顯升高。詳見表4。結(jié)果顯示：乳腺增生大鼠體內(nèi)E2和P水平失調(diào)。

3.5 乳癖消顆粒對(duì)乳腺增生大鼠血清中E2、P和E2/P的影響 與乳腺增生模型組大鼠對(duì)比，乳癖消顆粒各劑量組大鼠血清E2含量明顯降低(P<0.01)，P含量明顯增高(P<0.05)，E2/P比值明顯降低；與他莫昔芬組比較, 乳癖消顆粒各劑量組大鼠血清E2、P含量和E2/P比值無(wú)明顯的變化(P>0.05)。詳見表4。結(jié)果顯示:乳癖消顆粒有調(diào)節(jié)體內(nèi)E2、P含量，改善E2/P比值的作用。

組別n劑量E2(pmol/L)P(nmol/L)E2/P正常對(duì)照組102mL生理鹽水13884±2074 67148±3028 025±010 模型對(duì)照組102mL生理鹽水24240±6043??17194±10073??194±118??他莫昔芬組1018mg/kg17048±3019??41615±10172??042±004??乳癖消低劑量組1013g/kg15707±3022??44727±19169??042±022??乳癖消中劑量組1026g/kg13910±4502??32342±11941??045±010??乳癖消高劑量組1052g/kg13191±1425??32542±12663??046±017??

注：與正常對(duì)照組比較，** P<0.01；與模型對(duì)照組比較，## P<0.01

4 討論

乳腺增生癥病因并不明確，目前主要認(rèn)為是激素分泌失調(diào)，一是體內(nèi)雌激素過(guò)量不良刺激乳腺組織而使乳腺組織產(chǎn)生增生性變化，二是雌激素與孕激素平衡失調(diào)，患者血漿中E2水平明顯增高，黃體酮分泌相對(duì)不足，使乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張和囊腫形成，發(fā)生周期性增生過(guò)度和復(fù)原不全，致乳腺導(dǎo)管、小葉及周圍結(jié)締組織細(xì)胞增生。本實(shí)驗(yàn)采用雌孕激素制備大鼠乳腺增生病模型，制備的模型大鼠均表現(xiàn)為乳頭、乳房增大、血清中E2含量增高和P含量降低，E2/P比值失調(diào)。乳癖消能抑制實(shí)驗(yàn)性乳腺增生癥大鼠的乳頭和乳房增大，明顯降低血清E2濃度，升高P濃度，改善 E2/P比值。證實(shí)了乳腺增生與體內(nèi)激素分泌失調(diào)有關(guān)。

乳腺增生病的發(fā)生，除了體內(nèi)激素分泌改變之外，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺增生患者血清內(nèi)氧自由基增多,[4]應(yīng)用具有抗氧化能力的維生素治療乳腺囊性增生病臨床效果肯定，[5]與正常對(duì)照組比較，乳腺增生模型組大鼠血清中SOD及GSH-Px活性顯著降低，MDA含量明顯增多，[6-9]因此提示乳腺增生與體內(nèi)及乳腺組織內(nèi)氧自由基增多有關(guān)。

活性氧簇(ROS)是生物體細(xì)胞內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)的正常代謝產(chǎn)物，肌體在正常生理情況下，ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)肌體在有害因素的作用下，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，導(dǎo)致肌體ROS產(chǎn)生過(guò)多，引起蛋白變性，脂質(zhì)過(guò)氧化，DNA氧化損傷，從而誘發(fā)和加重疾病的發(fā)生發(fā)展。

8-OhdG、MDA 、SOD和GSP-Px是反應(yīng)體內(nèi)氧化抗氧化能力的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，乳腺增生模型組動(dòng)物血清中SOD及GSH-Px活性明顯減弱， MDA和8-OhdG含量明顯增多，也證實(shí)了乳腺增生的發(fā)生與乳腺組織的氧化損傷有關(guān)，表明除內(nèi)分泌失調(diào)外，氧自由基增多致使脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及DNA損傷也可能是引起乳腺增生的原因之一，可見抗氧自由基損傷可能是治療乳腺增生的機(jī)理之一。本研究發(fā)現(xiàn)，乳癖消顆粒降低血清MDA、8-OhdG含量、提高SOD及GSH-Px活性，提示乳癖消顆粒具有明顯的抗氧自由基損傷作用，從而達(dá)到治療乳腺增生的目的，為臨床上乳癖消治療乳腺增生病提供了一定的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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(2016-10-21 收稿)

*河北省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目：No.152777131；河北省人口計(jì)生委科研計(jì)劃項(xiàng)目：No.2010-C12；河北中醫(yī)學(xué)院青年自然基金項(xiàng)目：No.QNZ2015012

韓聚強(qiáng)，副教授，從事老年疾病研究。

R285.5

A

1007-5615(2016)04-0032-03

△石家莊市第一醫(yī)院(石家莊 050011)