王雪穎 米麗娜 楊錚 陳琪 劉陶迪 周好樂

·綜述·

基因功能的研究方法

王雪穎 米麗娜 楊錚 陳琪 劉陶迪 周好樂

隨著后基因組時代的到來，如何確定新基因的功能和已知基因的新功能已經(jīng)成為了一個主要研究方向。現(xiàn)今的研究方法包括生物信息學預測、基因轉(zhuǎn)導、反義技術(shù)等方法，而一些新技術(shù)的涌現(xiàn)，也為研究提供了新思路和新見解。

基因功能；生物信息學；反義技術(shù)

1986年，美國諾貝爾獎獲得者Renato Dulbecco在《Science》上發(fā)表的一篇名為“癌癥研究的轉(zhuǎn)折點——測定人類基因組序列”的短文中首次提出人類基因組計劃(human genome project，HGP)，此后生命科學逐漸進入后基因組時代。怎樣確定遺傳信息和基因的功能，將是現(xiàn)在乃至未來研究重點和方向。本文介紹了研究基因功能常用的一些方法以及一些新思路。

1 基因功能的預測

結(jié)構(gòu)決定功能是眾所周知的，對基因功能的研究可以從結(jié)構(gòu)上進行合理地預測或運用生物信息學方法，再通過實驗學方法進行驗證加以確定。

1.1 從結(jié)構(gòu)方面預測基因的功能 核苷酸的排列順序決定了基因的功能，利用DNA或蛋白質(zhì)序列之間的相似性來推斷基因的功能是第一種進行測試的方法也是迄今為止使用最廣泛的方法。通過對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)進行推導和探索，可以推測該蛋白質(zhì)的功能，為預測其基因的功能提供了有價值的信息以供參考。

1.2 運用生物信息學預測基因的功能 生物信息學(Bioinformatics)是以DNA和蛋白質(zhì)為研究對象，計算機為主要工具，對DNA和蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)進行提取、加工、分析等。生物信息學分析是確定在體內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用的有效途徑，已成為近年來非常受歡迎的方法[1]。研究人員已用微陣列表達數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、系統(tǒng)發(fā)生譜來預測基因的功能[2]。孫澤強等[3]利用現(xiàn)有的生物醫(yī)學文獻和基因組信息來確定基因之間的功能關(guān)系，開發(fā)了一個基于web的生物信息學的軟件——基因功能關(guān)系助手(GFRA)。GFRA可發(fā)現(xiàn)基因之間的功能聯(lián)系并將其分類。實現(xiàn)了從文本流和文本庫中挖掘知識，鑒定新基因之間的功能關(guān)系，對于驗證和分析由微陣列實驗提出的基因關(guān)聯(lián)有很大幫助。

2 基因的時空表達譜分析

基因的時空表達譜包括蛋白質(zhì)和mRNA兩個水平，基因在個體的不同組織和細胞中以及不同的發(fā)育階段表達均不相同，所以在研究基因功能之前，要分析基因的時空表達譜[4]。常用的方法有原位雜交、免疫組織化學、蛋白印跡技術(shù)、實時PCR技術(shù)等。

3 基因功能的實驗學方法

基因功能的實驗學方法既可以研究基因功能，也可以對預測后的基因加以驗證。

3.1 基因轉(zhuǎn)導 要了解一個基因有何功能，可以通過基因轉(zhuǎn)導(gene transduction)方法把目的基因有效安全地導入到靶細胞中，繼而觀察這個基因在細胞中的表達，此方法可分為利用非病毒的轉(zhuǎn)導方法和利用病毒的轉(zhuǎn)導方法。非病毒基因轉(zhuǎn)導要比病毒轉(zhuǎn)導方法安全，但其在組織中的表達是暫時的?？梢酝ㄟ^DNA直接注射、脂質(zhì)體介導DNA或受體介導，將目的基因轉(zhuǎn)入到細胞中。而在病毒轉(zhuǎn)導方法中多種病毒對哺乳動物細胞具有很強的感染能力，并能在宿主細胞內(nèi)復制表達。利用這一特性，選擇某些對人體無害的病毒，通過DNA重組技術(shù)，構(gòu)建病毒載體。病毒方法導入基因的效率一般高于非病毒方法。

3.2 人工染色體的轉(zhuǎn)導 在常用的酵母人工染色體(YACs)、細菌人工染色體(BACs)等基礎(chǔ)上研究出一種全新的載體系統(tǒng)——人類人工染色體(human artificial chromosomes，HACs)。HACs由著絲粒、端粒和復制起點組成，其作為載體則可以攜帶基因的所有外顯子或多個基因以及完整基因和附近調(diào)控區(qū)的大片段DNA，從而將目的基因調(diào)控序列一并導入細胞內(nèi)，避免了整合到人其他染色體的可能及位置效應，大大提高了基因治療的有效性和安全性，不存在大小上限的DNA克隆到HAC——整個基因組座位與所有調(diào)節(jié)元件都可以使用[5]。HACs對于功能基因組學，基因治療和合成生物學其代表了一個新的有前景的游離基因系統(tǒng)[6]。

3.3 基因編輯新技術(shù) 基因編輯新技術(shù)是指經(jīng)過人工改造的核酸酶介導的基因組編輯技術(shù)(genome editing with engineered nucleases)，也稱RNA引導性基因編輯技術(shù)[7]。其主要有類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)、鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和RNA引導的CRISPR-Cas9核酸酶技術(shù)(CRISPR-Cas9 RGNs)。

3.3.1 TALEN TALE來自于植物黃單胞菌(Xanthomonas)，是具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白。宿主基因啟動子區(qū)的相應核苷酸序列與其DNA結(jié)構(gòu)域進行特異性結(jié)合，從而激活基因表達。TALEN技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于細胞、酵母、斑馬魚與大鼠等各類研究對象[8]。

3.3.2 ZFN ZFN有與TALEN截然不同的DNA識別和結(jié)合域。ZFN由鋅指蛋白(zinc finger protein，ZFP)和FokⅠ核酸內(nèi)切酶組成，ZFN與相應的FokⅠ域形成異源二聚體，從而使FokⅠ域激活，催化DNA雙鏈在特定位點斷裂，再根據(jù)模板決定采用同源重組機制來修復斷裂或非同源末端連接的方法。迄今為止，ZFN已被用于靶向許多基因在不同的生物體，例如大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、玉米等生物的細胞在人體外培養(yǎng)細胞系中成功地實現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點突變[9]。

3.3.3 CRISPR-Cas9 RGNs 通過一段短的引導RNA(guide RNA)來識別特定的DNA序列，改變這段引導RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列上。使DNA結(jié)構(gòu)域與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白結(jié)合，從而對特定基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制[10-11]。此方法具有操作簡單、特異性高的特點，已成為當下的研究熱點。

3.4 反義技術(shù) 反義技術(shù)(antisense techniques)是根據(jù)堿基互補原理，干擾DNA雙鏈的解螺旋、復制、轉(zhuǎn)錄以及mRNA的剪接加工和翻譯等各個階段。包括反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，ASON)技術(shù)、核酶(Ribozyme)技術(shù)和小RNA干擾(small interfering，siRNA)技術(shù)。

3.4.1 反義寡核苷酸技術(shù) 利用基因重組技術(shù)，遵循堿基互補配對原則，通過構(gòu)建人工表達載體，對基因表達的多個環(huán)節(jié)進行干擾，從而調(diào)節(jié)細胞的生長分化過程。與其他基因或蛋白抑制劑相比，反義寡核苷酸具有特異性高、抑制基因范圍廣以及抑制靶基因程度可調(diào)控等獨特的優(yōu)點。

3.4.2 核酶技術(shù) 核酶是具有催化功能的小分子RNA，又稱催化性RNA。具有酶的活性，可催化特定的RNA降解。核酶技術(shù)就是利用核酶特有的催化活性，通過堿基配對原則，滅活特異性靶RNA分子。其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以催化效率比反義寡核苷酸高[12]。常見的核酶形態(tài)有三種：錘頭狀、發(fā)夾狀和斧頭狀。

3.4.3 小RNA干擾技術(shù) siRNA是細胞內(nèi)一類雙鏈RNA在特定情況下通過一定酶切機制，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂刑囟ㄐ蛄械男∑蜶NA。siRNA與一些蛋白質(zhì)RNA誘導的沉默復合物(RNA-Induced silencing complex，RISC)，與特異性靶mRNA結(jié)合使其降解，阻斷翻譯過程。siRNA能夠通過RNA干擾(RNAi)途徑催化沉默特定的基因，是有吸引力的備選治療方法，適用于大多數(shù)疾病，包括遺傳疾病和癌癥[13]。它可以用來抑制體外和體內(nèi)特定基因的表達，具有特異、高效、穩(wěn)定性強、操作簡便等特點[14]。Beronja等[15]開發(fā)了用于皮膚RNAi介導的基因功能分析的方法，它采用超聲引導在9只胚胎期小鼠子宮羊膜腔微量注射慢病毒載體，使其快速、有效和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導到小鼠皮膚上。這個技術(shù)不需要動物交配，在操作和和表型分析之間可能只需要短短幾天的時間，用最簡單的形式，比如說通過shRNA介導的基因敲除的單基因功能分析。他們的技術(shù)極大地擴展了在表皮生物學中存在的突出問題的全面功能檢查。

3.5 微陣列分析 微陣列(microarray)是近年來發(fā)展起來的一項研究基因功能的新技術(shù)。指的是由許多DNA樣品或寡核苷酸，密集排列于玻片、硅片或尼龍膜等固相支持物上與模板進行雜交，通過計算機獲取圖像信息從而進行分析處理。采用微陣列技術(shù)，可以對生物體在不同的生長發(fā)育階段或不同的生理狀態(tài)下DNA或RNA表達水平進行檢測，隨著分子生物學的進步，微陣列已成為探查人類復雜疾病的重要資源，可用于快速檢測大規(guī)模DNA序列多態(tài)性、基因組表達譜、基因差異表達、疾病相關(guān)基因[16-17]。

3.6 單倍體胚胎干細胞研究 單倍體胚胎干細胞(Haploid embryonic stem cells，haESCs)是一種對胚胎干細胞新的應用方式。由于單倍體細胞僅含有單套染色體，適合于基因分析，且haESC擁有在體外無限增殖，并可以分化成多種功能細胞、組織以及器官的細胞類群的特性[18-19]。研究人員通過對單倍體胚胎干細胞中的某些基因進行修飾，從而研究特定基因在受精過程中的功能[20]。這些單倍體胚胎干細胞的明顯特征使自己不僅成為了在細胞水平上對基因篩查的有價值的工具，而且也作為一種研究哺乳動物基因功能新的理想工具[21]。

HaESC可分為孤雄單倍體胚胎干細胞(androgenetic haploid mbrvonic stem cell，AG-haESC)和孤雌單倍體胚胎干細胞(parthenogenetic haploid embryonic stem cell，PG-haESC)。在幾年前Elling U等[22]和Leeb M等[23]用不同的方法建立了小鼠孤雌胚胎源單倍體胚胎干細胞系；而Yang H等[24]建立了孤雄單倍體干細胞系，采用了去除受精卵中的雌原核和向去核的卵母細胞中注射成熟精子的頭部2種不同的方法，從此開啟了關(guān)于多種細胞及發(fā)育過程基因有效功能學篩選的相關(guān)研究。隨著haESC的研究價值逐步提高，涌現(xiàn)了越來越多關(guān)于它的研究成果，比如，利用基因修飾獲得的haESC的轉(zhuǎn)基因動物。Monfort A等[25]利用單倍體小鼠胚胎干細胞(ESCs)使X染色體失活，從而識別出哪些基因的表達是需要X染色體抑制的。進一步證明了haESC不僅在遺傳篩查中發(fā)揮作用，更說明了其在基因功能研究方面的價值。

4 展望

基因功能的研究方法是我們研究疾病的重要途徑之一。本文所介紹的方法各有優(yōu)良，但相輔相成。隨著研究的不斷發(fā)展和深入，我們不僅要完善現(xiàn)有的方法，而且要繼續(xù)發(fā)展、探索一些新技術(shù)?；蜃鳛槿祟悅鞒械母荆侨祟惿L發(fā)育過程中不可缺少的一部分，更在人類的疾病、衰老和死亡過程中發(fā)揮著功能。但人體中的基因數(shù)以千萬，大多數(shù)基因的功能尚未發(fā)現(xiàn)，如何揭開它的神秘面紗，就需要更多更新的方法來幫助研究人員全面了解基因如何在體內(nèi)發(fā)揮功能以及相互協(xié)調(diào)，進而探索出人類生老病死的奧秘。

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With the advent of the post-genomic era，it has become a major research direction to determine the unknown functions of the new genes and the new functions of the known genes.The current research methods include bioinformatics prediction，gene transduction，antisense technology，and so on.Meanwhile，the emergence of other new technologies provides some new ideas and insights for the related studies.

Gene function；Bioinformatics；Antisense technology

2016-07-06)

國家自然科學基金項目(81260111)；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中青年人才團隊項目(NYTD-2015003)

1005-619X(2017)02-0131-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.02.007

010100 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學心身醫(yī)學研究室

劉陶迪，周好樂