徐子涵，商瑋，趙凌杰，董曉蕾，郭郡浩，劉春麗，常文靜，張蓓蓓，蔡輝,

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京 210002)

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姜黃素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者破骨細(xì)胞生成數(shù)量和活性的影響

徐子涵1，商瑋2，趙凌杰2，董曉蕾2，郭郡浩2，劉春麗2，常文靜2，張蓓蓓2，蔡輝1,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京 210002)

目的 研究姜黃素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者破骨細(xì)胞生成數(shù)量和活性的影響。方法 采集RA患者外周血，密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)，經(jīng)核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)誘導(dǎo)分化，分別采用不同濃度(2.5、5、10 μmol·L-1)姜黃素進(jìn)行干預(yù)；根據(jù)姜黃素濃度將實(shí)驗(yàn)分為4組，即空白對照組、姜黃素低濃度組、姜黃素中濃度組和姜黃素高濃度組；14 d后行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測破骨細(xì)胞并計(jì)數(shù)；檢測細(xì)胞TRAP活性。結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，姜黃素低、中、高濃度組的TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)(個/10個視野)分別為96.89±3.51、76.44±1.88和62.56±2.70，均低于空白對照組131.00±4.03(P<0.05)；各濃度組的TRAP活性(U·L-1)分別為5.74±0.36、4.21±0.12和3.06±0.07，均低于空白對照組7.48±0.22(P<0.05)。結(jié)論 姜黃素抑制RA患者PBMCs生成破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性，且隨著姜黃素濃度的增加，抑制作用呈增強(qiáng)趨勢。

姜黃素；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；外周血單個核細(xì)胞；破骨細(xì)胞

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性進(jìn)展性滑膜炎癥為特征的自身免疫性疾病。除四肢小關(guān)節(jié)炎癥外，以骨量丟失為表現(xiàn)的骨代謝異常貫穿于RA的整個病程中，是造成RA患者關(guān)節(jié)變形，功能減退，高骨折發(fā)生率和殘疾的主要原因。破骨細(xì)胞主要行使骨吸收功能，主要來源于造血干細(xì)胞的單核/巨噬細(xì)胞前體。在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)等細(xì)胞因子的作用下，單核細(xì)胞前體細(xì)胞分化、融合，形成多核破骨細(xì)胞，表達(dá)抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)和降鈣素受體(calcitonin receptor，CTR)等特異性基因，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix Metalloproteinases，MMPs)和CatK等蛋白水解酶，從而降解有機(jī)骨基質(zhì)[1]。

姜黃素(curcumin)是從中藥姜黃中提取的一種低分子量的酚類物質(zhì)。Cho等[2]研究表明，姜黃素具有降低骨吸收強(qiáng)度、改善骨質(zhì)疏松的作用。這可能與它能降低骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的形成有關(guān)[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能增加實(shí)驗(yàn)大鼠骨密度，抑制其骨丟失[4]。為進(jìn)一步探討姜黃素防治RA骨量丟失的潛在機(jī)制，本研究通過體外誘導(dǎo)RA患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)生成破骨細(xì)胞，并觀察姜黃素對破骨細(xì)胞生成數(shù)量和活性的影響，探討姜黃素對破骨細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)機(jī)制和作用。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 收集2014年7月至2014年12月，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科門診及住院RA患者15例，其中男性3例，女性12例，平均年齡(46±15)歲，均符合2010年RA的ACR/EULAR分類標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RANKL、M-CSF(美國Pepro Tech公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，TRAP染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TRAP檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù))。

1.3 PBMCs的分離與培養(yǎng) 取RA患者外周血8 mL，用Ficoll密度梯度離心方法分離PBMCs，用PBS清洗2次，用α-MEM培養(yǎng)液配制成濃度為2×106·L-1細(xì)胞懸液，接種于24 孔培養(yǎng)板中，每孔800 μL。在37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 分組 共設(shè)4組：空白對照組、姜黃素低濃度組、姜黃素中濃度組和姜黃素高濃度組，每組設(shè)3個平行樣本。培養(yǎng)2 h后，空白對照組每孔加入800 μL 誘導(dǎo)培養(yǎng)液[RANKL(100 μg·L-1)和M-CSF(50 μg·L-1)]，姜黃素低、中、高濃度組每孔分別加入800 μL含不同濃度(2.5、5、10 μmol·L-1)姜黃素的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液1次。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞融合以及多核細(xì)胞形成的情況，并拍照。

1.6 TARP染色并計(jì)數(shù) 用細(xì)胞固定液固定30 s，去離子水沖洗，加入配制好的TRAP 反應(yīng)液37 ℃恒溫孵育60 min，去離子水沖洗 3 次，干燥，用蘇木精復(fù)染3～5 min，堿性液沖洗，晾干。光學(xué)顯微鏡(200×)下，隨機(jī)選取10個視野，計(jì)數(shù)TRAP陽性細(xì)胞(細(xì)胞核≥3 個，胞質(zhì)呈酒紅色)，取均值，結(jié)果用“個/10個視野”表示，每孔重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.7 TRAP活性測定 用PBS洗3次，用TRIzol液裂解細(xì)胞，勻漿，離心取上清。參照按說明書配置相關(guān)試劑，設(shè)置空白對照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，加入試劑及細(xì)胞裂解液，混勻后37 ℃孵育10 min，每孔加入160 μL反應(yīng)終止液，在405 nm測定吸光度。以在pH4.8，37 ℃條件下，每分鐘對硝基苯磷酸二鈉顯色底物產(chǎn)生1 nmol對硝基酚所需的酸性磷酸酶的量定義為一個TRAP活力單位。根據(jù)酶活性定義，計(jì)算出樣品中的TRAP活性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 剛接種后觀察細(xì)胞數(shù)量較多，體積小，都呈圓形，折光性強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)第7天，觀察見培養(yǎng)的細(xì)胞中有個別細(xì)胞體積增大，輪廓清晰，呈橢圓形或不規(guī)則形，并有細(xì)長的偽足，細(xì)胞核體積增大，呈圓形或橢圓形。第14天，可見多個多核細(xì)胞，胞體明顯增大，折光性強(qiáng)，形態(tài)有油煎蛋形、漏斗形或不規(guī)則形，有裙?fàn)罨蚪z狀偽足，胞內(nèi)有3～5個以上的細(xì)胞核，胞漿中有較多空泡，符合破骨細(xì)胞的形態(tài)特征(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(200×)

2.2 TRAP染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 如圖2所示，結(jié)果顯示，空白對照組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)較多，體積較大，染色較深。相比而言，姜黃素低、中、高各濃度組中形成的TRAP陽性細(xì)胞數(shù)較少，體積較小，染色較淡。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：姜黃素低、中、高濃度組破骨細(xì)胞數(shù)量均較空白對照組少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

注：A.空白對照組；B.姜黃素低濃度組；C.姜黃素中濃度組；D.姜黃素高濃度組

圖2 TRAP染色(200×)

2.3 TRAP活性測定結(jié)果 如表1所示，姜黃素低、中、高濃度組的TRAP活性均低于與空白對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)、TRAP活性比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05。

3 討論

RA是臨床上常見的結(jié)締組織病，以滑膜炎、滑膜增生及血管翳形成為基本特征[6]，此外，骨量丟失也是RA常見的病理改變，包括關(guān)節(jié)周圍骨量減少、骨侵蝕和廣泛性骨質(zhì)疏松。在人體內(nèi)，骨骼不間斷地重復(fù)著清除陳舊骨及形成新骨的骨重建過程，在正常生理?xiàng)l件下，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞相互偶聯(lián)與調(diào)節(jié)，以維持骨代謝平衡[7]。目前研究認(rèn)為破骨細(xì)胞數(shù)量增加，活性增強(qiáng)，以骨吸收增加為主的骨代謝失衡是RA骨量丟失的主要原因[8]。

破骨細(xì)胞是人體內(nèi)唯一具有骨破壞能力的細(xì)胞，它來源于單核巨噬細(xì)胞系的多核終末分化細(xì)胞。這些細(xì)胞具有向骨吸收區(qū)移動的特性，可黏附于骨表面分化為單核的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，并進(jìn)一步互相融合成為多核巨細(xì)胞，分泌CatK、MMP-9 和TRAP5等蛋白水解酶進(jìn)入骨吸收陷窩，并通過質(zhì)子泵分泌H+，降解骨基質(zhì)。

破骨細(xì)胞具有不能傳代、存活時(shí)間短等特點(diǎn)，且破骨細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量極少，難以分離獲得[9]。破骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有分離法和誘導(dǎo)法。Fujikawa等[10]首次應(yīng)用人外周血分離的單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)出破骨細(xì)胞，該培養(yǎng)法具有來源豐富、取材方便等優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中為促進(jìn)前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，必須使用兩種誘導(dǎo)劑，分別是RANKL和M-CSF，兩者缺一不可，共同發(fā)揮誘導(dǎo)作用[11]。本實(shí)驗(yàn)為體外培養(yǎng)RA患者的破骨細(xì)胞，選用PBMC誘導(dǎo)法，通過加用RANKL和M-CSF兩種誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。

破骨細(xì)胞的鑒定主要從細(xì)胞形態(tài)、TRAP 染色、TRAP活性檢測等方面進(jìn)行。誘導(dǎo)成熟的破骨細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形，胞體較大，胞核為3～15 個，邊界不整見偽足。TRAP是酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)同工酶的第5型，為破骨細(xì)胞所特有，直接參與破骨細(xì)胞的骨吸收過程。TRAP染色是鑒定破骨細(xì)胞的常用方法，通常將TRAP染色陽性、胞核≥3個的細(xì)胞認(rèn)定為破骨細(xì)胞，通過TRAP染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，可以評估誘導(dǎo)生成的破骨細(xì)胞的數(shù)量。TRAP活性水平被認(rèn)為是反映破骨細(xì)胞功能以及臨床判斷骨吸收的敏感而特異性指標(biāo)。因此，可以通過這幾個方面來觀察破骨細(xì)胞的數(shù)量和分泌活性。

姜黃(curcumalongaL)為姜科草本植物姜黃的干燥根莖，其味辛、苦，性溫，入肝脾二經(jīng)，具有行氣、散風(fēng)活血、通經(jīng)止痛之功效。姜黃素是從姜黃中提取的一種低分子量的酚類物質(zhì)，現(xiàn)有研究證實(shí)它具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抑制血管新生、抗動脈粥樣硬化和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用，與其能影響NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，TNF-α、IL-1等細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)[12]。Hussan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能減少破骨細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)增加成骨細(xì)胞數(shù)量，從而對卵巢切除后大鼠骨丟失有一定治療作用。

本研究采用RA患者PBMCs誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞，并在培養(yǎng)過程中用低、中、高濃度的姜黃素進(jìn)行干預(yù)，通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、TRAP染色和計(jì)數(shù)觀察姜黃素對破骨細(xì)胞生成數(shù)量的影響，檢測細(xì)胞TRAP活性觀察姜黃素對破骨細(xì)胞分泌活性的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，姜黃素各濃度組均能減少RA患者PBMCs生成破骨細(xì)胞的數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞分泌的TRAP活性，且隨著姜黃素濃度的增加，抑制作用更明顯。因此，我們認(rèn)為姜黃素具有抑制RA患者破骨細(xì)胞生成數(shù)量和活性的作用，為臨床應(yīng)用姜黃素防治RA骨破壞提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of curcumin on the number and activity of osteoclasts in patients with rheumatoid arthritis

XU Zihan1，SHANG Wei2，ZHAO Lingjie2，et al

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing，Jiangsu210023，China；2.DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，PLA，Nanjing，Jiangsu210002，China)

Objective To investigate the effects of curcumin on the osteoclastogenesis from rheumatoid arthritis(RA)patients in vitro.Methods Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)from patients with RA separated by density centrifugation were cultured in the medium containing M-CSF and RANKL,added with different concentrations of curcumin in the process.There were 4 groups named blank control group,curcumin 2.5 μmol·L-1group,curcumin 5 μmol·L-1group and curcumin 10 μmol·L-1group.After cultured for 14 days,TRAP staining was used for the detection and calculation of osteoclasts and the activity of TRAP was evaluated.Results After cultured for 14 days,the number of TRAP-positive osteoclasts were decreased significantly in curcumin 2.5 μmol·L-1group(96.89±3.51),curcumin 5 μmol·L-1group(76.44±1.88),curcumin 10 μmol·L-1group(62.56±2.70),which were significantly lower than that in the blank control group(131.00±4.03,P<0.05).The activities of TRAP in 2.5 μmol·L-1group,5 μmol·L-1group and 10 μmol·L-1group were 5.74±0.36 U·L-1,4.21±0.12 U·L-1and 3.06±0.07 U·L-1,which were lower than that in the blank control group(7.48±0.22 U·L-1,P<0.05).Conclusions Curcumin can inhibit the osteoclastogenesis of the PBMCs from RA patients,and the inhibition effect is enhanced with the increase in the concentration of curcumin.

Curcumin;Rheumatoid arthritis;Peripheral blood mononuclear cell;Osteoclast

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院科研基金(2015039)

蔡輝，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：njzy_caihui@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.043

2016-04-14，

2016-07-20)