朱敏杰，郝海英，陳潔，趙京梅，郝曉娟

(邯鄲市中心醫(yī)院,a.腎內(nèi)二科，b.腎呼吸內(nèi)科，河北 邯鄲 056001)

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◇藥學(xué)研究◇

葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

朱敏杰a，郝海英a，陳潔a，趙京梅b，郝曉娟a

(邯鄲市中心醫(yī)院,a.腎內(nèi)二科，b.腎呼吸內(nèi)科，河北 邯鄲 056001)

目的 研究葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 將120只實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：假手術(shù)組，模型組，葛根素高劑量(100 mg·kg-1)、中劑量(50 mg·kg-1)、低劑量(25 mg·kg-1)治療組，銀杏葉提取物(100 mg·kg-1)治療組；采用夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復(fù)血流灌注的方法建立腎缺血再灌注大鼠模型；再灌注后立即腹腔注射給藥，每天1次，療程2周。稱(chēng)量各組大鼠體質(zhì)量、腎臟重量并計(jì)算腎臟指數(shù)，測(cè)定24 h尿量和24 h尿蛋白量(UPro)，測(cè)定血清中血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)含量，通過(guò)蘇木精-尹紅(HE)染色觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察腎小球細(xì)胞凋亡狀況，并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)；測(cè)定腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量，通過(guò)ELISA法測(cè)定血清中白介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量水平。結(jié)果 較模型組，葛根素高、中劑量組大鼠腎臟重量減輕且腎臟指數(shù)降低，24 h尿量和UPro均減少，血清中BUN、SCr、UA含量降低，上述均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；葛根素治療組大鼠腎臟組織病變和腎小球細(xì)胞凋亡狀況呈不同程度改善，以葛根素高劑量組效果最為顯著，并且葛根素高、中劑量組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組降低(P<0.05，P<0.01)；葛根素高、中劑量組腎臟組織中SOD、CAT活性升高且MDA含量降低，血清中IL-1和TNF-α含量降低，且高劑量組GSH-Px活性升高，上述均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織具有保護(hù)作用；其機(jī)制可能與葛根素能夠有效改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

葛根素；腎臟；缺血再灌注；保護(hù)；機(jī)制

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是臨床上開(kāi)展腎臟手術(shù)以及失血、休克時(shí)常發(fā)生的腎組織損傷現(xiàn)象，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年來(lái)病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)隨著腎臟血流恢復(fù)供應(yīng)，氧大量涌入而導(dǎo)致氧自由基的大量生成與過(guò)剩，誘發(fā)腎臟組織氧化應(yīng)激損傷以及繼發(fā)的細(xì)胞凋亡是造成RIRI的重要因素[1-2]。黃仁發(fā)等[3]研究均發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)在RIRI的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中也發(fā)揮著重要作用。葛根素(puerarin)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥葛根的主要有效成分，現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，葛根素屬于異黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、調(diào)脂、抗凋亡等多種生物學(xué)活性[4-7]。銀杏葉提取物具有活血、化淤、通絡(luò)的功效，廣泛應(yīng)用于腦部及周?chē)餮h(huán)障礙[8]，并且銀杏葉提取物能夠改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制腎小球細(xì)胞凋亡而對(duì)RIRI起到確切的保護(hù)作用[9]。本研究采用夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復(fù)血流再灌注的方法建立的腎缺血再灌注大鼠模型，并以銀杏葉提取物為陽(yáng)性對(duì)照，研究葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 葛根素注射液(江西銀濤藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 mL:100 mg，批號(hào) 20140518)；金納多注射液(德國(guó)威瑪舒培大藥廠，每支5 mL，含有銀杏提取物17.5 mg，批號(hào)1514904)；血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)、24 h尿蛋白量(UPro)試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒，TUNEL染色試劑盒購(gòu)自北京博奧森公司；烏拉坦購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠(清潔級(jí)，雄性，7周齡，體質(zhì)量180～220 g)，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003，動(dòng)物批號(hào)：20140912。

1.3 主要儀器 UV759紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)；BS-200型生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；iMark型酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與模型的制備 將120只實(shí)驗(yàn)用SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組，模型組，葛根素高劑量(100 mg·kg-1)、中劑量(50 mg·kg-1)、低劑量(25 mg·kg-1)治療組，銀杏葉提取物(100 mg·kg-1)治療組，各20只；除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均參照Chatterjee等[10]報(bào)道的方法制備腎缺血再灌注大鼠模型：實(shí)施麻醉后于脊柱雙側(cè)行腎區(qū)切口、暴露雙側(cè)腎臟，剝離雙側(cè)腎蒂血管并用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉45 min后松夾恢復(fù)血流灌注，逐層縫合；假手術(shù)組大鼠行手術(shù)通路但不夾閉腎蒂血管。通過(guò)HE染色觀察組織病理切片發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整、腎小管結(jié)構(gòu)完整；而模型組大鼠腎臟組織呈現(xiàn)腎小管結(jié)構(gòu)破壞、腎小管上皮細(xì)胞變性壞死、管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的細(xì)胞和管型尿，間質(zhì)區(qū)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等明顯的病理性形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果見(jiàn)圖1，說(shuō)明造模成功。各治療組分別于再灌注后立即通過(guò)腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組均同步給予等體積生理鹽水，每天1次，療程2周。

圖1 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化(HE×400)

2.2 體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量的稱(chēng)量及腎臟指數(shù)的計(jì)算 治療完成后稱(chēng)量各組大鼠體質(zhì)量；麻醉后取腎臟組織并稱(chēng)量左側(cè)腎質(zhì)量，然后計(jì)算腎臟指數(shù)：

腎臟指數(shù)(mg·g-1)=左側(cè)腎臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.3 24 h尿量及UPro的測(cè)定 治療完成后，插導(dǎo)尿管并測(cè)量各組大鼠24 h尿量，并按照試劑盒操作方法步驟分析測(cè)定各組大鼠UPro水平。

2.4 血清中BUN、SCr、UA含量的測(cè)定 治療完成后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，離心(2 000 r·min-1，5 min)后取血清，按照各測(cè)定試劑盒操作方法進(jìn)行處理后，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清中BUN、SCr、UA含量。

2.5 腎臟組織形態(tài)結(jié)果改變的觀察 取“2.2”步驟稱(chēng)量后的左側(cè)腎臟組織，置于4%的多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)和展片處理后，行常規(guī)HE染色和復(fù)染，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2.6 腎小球細(xì)胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)的計(jì)算 取“2.5”所制備的石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化處理后，按照TUNEL染色試劑盒操作方法步驟依次進(jìn)行處理，然后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡狀況。AI的計(jì)算：每只大鼠取5張切片，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)以及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核黃染)，取平均值，然后計(jì)算AI：

AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%

2.7 腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的測(cè)定 取右側(cè)腎臟組織，剪碎、加入適量冷裂解液后研磨勻漿，離心(3 000 r·min-1，10 min)后取上清液，然后按照試劑盒操作方法步驟，采用比色法、通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光度計(jì)測(cè)定各組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

2.8 血清中IL-1和TNF-α含量的測(cè)定 取“2.4”所制備的血清，按照ELISA試劑盒操作方法步驟進(jìn)行處理，最后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定各組大鼠血清中IL-1和TNF-α含量。

3 結(jié)果

3.1 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響 結(jié)果如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)均升高(P<0.01)；經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟質(zhì)量減輕且腎臟指數(shù)降低(P<0.05，P<0.01)。

3.2 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠24 h尿量和UPro的影響 結(jié)果如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠24 h尿量和UPro均升高(P<0.01)；經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠24 h尿量和UPro均降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,cP<0.01。

表2 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠24 h尿量和UPro的影響

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

3.3 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠血清中BUN、SCr、UA含量的影響 結(jié)果如表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中BUN、SCr、UA含量升高(P<0.01)；經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠血清中BUN、SCr、UA含量降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠血清中BUN、SCr、UA含量的影響

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

3.4 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎小球細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果如圖2所示，假手術(shù)組大鼠腎臟組織僅存在極少量的凋亡細(xì)胞；而模型組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，經(jīng)葛根素治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠腎小球細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，以葛根素高劑量組效果最為顯著；計(jì)算AI結(jié)果如表4所示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠細(xì)胞AI升高(P<0.01)，經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞AI降低(P<0.05，P<0.01)。

圖2 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎小球細(xì)胞凋亡的影響(HE×400)

表4 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎小球細(xì)胞AI的影響

注：與假手術(shù)組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

3.5 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響 結(jié)果如表5所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性低且MDA含量升高(P<0.01)；經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后，腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中SOD、CAT活性升高且MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)，高劑量治療組GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。

3.6 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量的影響 結(jié)果如表6所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-1和TNF-α含量均升高(P<0.01)；經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后，腎臟缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量降低(P<0.05，P<0.01)。

表5 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響

注：與假手術(shù)組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

表6 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量的影響

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

4 討論

腎臟組織血流量非常豐富，對(duì)缺血再灌注損傷非常敏感，常見(jiàn)于腎臟手術(shù)、嚴(yán)重出血、休克等之后。RIRI是導(dǎo)致腎功能衰竭的危險(xiǎn)因素之一，其死亡率高達(dá)50%以上[11]。目前對(duì)RIRI的發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)以及繼發(fā)的細(xì)胞凋亡在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。游離并夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復(fù)血流灌注是制備RIRI大鼠模型的常用方法[10]，該方法制備的模型大鼠呈現(xiàn)腎臟組織氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及腎小管率過(guò)濾升高且重吸收率降低所致尿量、24 h UPro、BUN、SCr、UA增多等病理性改變。

體內(nèi)活性氧自由基(ROS)過(guò)剩是導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的病理基礎(chǔ)，正常生理狀態(tài)下，ROS的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，其中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)對(duì)ROS的清除發(fā)揮著重要的催化作用[12-14]；當(dāng)ROS生成增多或抗氧化酶活性降低時(shí)，將導(dǎo)致體內(nèi)ROS的過(guò)剩而攻擊細(xì)胞膜而造成臟器的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，因此脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映氧化應(yīng)激損傷程度。炎癥因子IL-1和TNF-α在RIRI的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用[15]，IL-1能夠引發(fā)中性粒細(xì)胞向腎組織浸潤(rùn)，從而加劇腎組織損傷；TNF-α不但具有直接細(xì)胞毒作用，而且還能夠促進(jìn)IL-1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而加劇炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和聚集。

細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡，該過(guò)程中存在著非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，其中Bcl-2基因家族和Caspase蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著非常重要的調(diào)控作用[16]。細(xì)胞凋亡具有多種誘發(fā)因素，包括氧化應(yīng)激損傷，而NF-κB蛋白則被稱(chēng)為連接氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的“橋梁”；常態(tài)下，NF-κB以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)中，而當(dāng)受到外界因素刺激時(shí)NF-κB將進(jìn)入胞核并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

本研究通過(guò)夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復(fù)血流灌注的方法建立腎缺血再灌注大鼠模型，通過(guò)HE染色觀察病理切片、TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡、檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子以及尿量、UPro、BUN、SCr、UA指標(biāo)發(fā)現(xiàn)其病理性改變與Chatterjee等[10]的研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)葛根素治療能夠有效降低RIRI大鼠腎臟指數(shù)，減少尿量和尿蛋白量，降低BUN、SCr、UA含量，改善腎功能、降低腎小管率過(guò)濾、提高腎小管重吸收率，改善腎臟組織病變、抑制腎小球細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，葛根素治療能夠有效改善RIRI大鼠腎臟組織抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性、降低MDA含量、降低炎癥細(xì)胞因子(IL-1、TNF-α)水平；提示葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與葛根素能夠改善腎小球?yàn)V過(guò)率和腎小管重吸收率、降低尿量，抑制氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)有關(guān)。

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Protection and mechanism of puerarin on the kidneys in ischemic-reperfusion rats

ZHU Minjie,HAO Haiying,CHEN Jie,et al

(SecondDepartmentofNephrology,HandanCentralHospital,Handan,Hebei056001,China)

Objective To investigate the protection and mechanism of puerarin on the kidneys in ischemic-reperfusion rats.Methods One hundred and twenty experimental rats were randomized into six groups:sham operation group,renal ischemic-reperfusion model control group,puerarin 25,50,100 mg·kg-1treatment groups and ginkgo biloba extract(EGb)100 mg·kg-1treatment group.The model rats were made by gripping bilateral renal pedicle vascular for 45min,then the drugs were given immediately after reperfusion,once a day for 2 weeks.Two weeks later,the body mass and renal weight were determined and the renal index(RI)was calculated;the urine volume and the UPro were determined;the content of BUN,SCr,UA in serum were determined;the histopathological changes of renal tissue were observed by HE staining;the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining,and the apoptosis index(AI)was calculated;the activities of SOD,GSH-Px and CAT and the content of MDA in renal tissue were determined;the contents of IL-1 and TNF-α in serum were determined by ELISA.Results Compared with renal ischemic-reperfusion model control group,the renal weight and RI in puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01);the urine volume and the UPro in puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),and the content of BUN,SCr,UA in serum were significantly decreased(P<0.05,P<0.01).The histopathological changes and the apoptosis of the renal tissue in puerarin treatment groups were significantly improved,especially in the puerarin 100 mg·kg-1treatment group,and theAIof puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01).The activities of SOD,CAT in renal tissue of puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly increased and the contents of MDA were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),the contents of IL-1 and TNF-α in serum were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),and the activity of GSH-Px of puerarin 100 mg·kg-1treatment group was significantly increased(P<0.05,P<0.01).Conclusions Puerarin had protective effects on kidneys in ischemic-reperfusion rats,which was perhaps related to its effects on improving the activity of antioxidant enzymes,reducing oxidative stress injury and inhibiting inflammatory response.

Puerarin;Kidneys;Ischemic-reperfusion;Protection;Mechanism

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.006

2016-04-23，

2016-08-07)