劉仔，蓬展鵬，鄺惠珍，董明國

(東莞市中醫(yī)院藥學部，廣東 東莞 523000)

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金沙?；咝б合嗌V指紋圖譜研究

劉仔，蓬展鵬，鄺惠珍，董明國

(東莞市中醫(yī)院藥學部，廣東 東莞 523000)

目的 建立金沙?；咝б合嗌V(HPLC)法指紋圖譜，為科學評價金沙牛化石片質(zhì)量及其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性提供依據(jù)。方法 采用AgiLent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，以0.2%磷酸-乙腈為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為254 nm，柱溫為25 ℃。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”對10批金沙?；M行相似度評價。結(jié)果 以夏佛塔苷為參照峰，初步建立了金沙牛化石片HPLC指紋圖譜，確定了18個共有峰，10批金沙?；瑯悠分讣y圖譜相似度均在0.9以上。結(jié)論 該方法簡便、準確、重復性好，可用于金沙?；|(zhì)量控制。

金沙?；?；高效液相色譜；指紋圖譜

金沙?；?，批準文號：粵藥制字Z20070471，是由金沙牛、廣金錢草、穿山甲、雞內(nèi)金、滑石、川牛膝、海金沙、冬葵果、皂角刺、桃仁、三七、石韋多種中藥材提取加工制成，根據(jù)我院老中醫(yī)多年臨床經(jīng)驗所得，應用于治療泌尿結(jié)石、尿路感染等癥狀療效顯著[1-2]。課題組前期研究表明[3]，該藥具有增加尿量、增加尿液中枸櫞酸、減少尿酸及減輕尿路感染炎性反應而發(fā)揮防治泌尿系結(jié)石的作用。

目前，關(guān)于金沙?；|(zhì)量控制方面的研究尚未見報道，難以客觀反映該藥的整體質(zhì)量狀況以及各生產(chǎn)批次的優(yōu)劣情況。而中藥指紋圖譜技術(shù)具有系統(tǒng)性、整體性和穩(wěn)定性等特點，可較好地反映含有復雜成分的中藥制劑其內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，是解決金沙?；a(chǎn)質(zhì)量問題的有效手段[4-8]。因此，本文建立了金沙?；讣y圖譜的分析方法，對不同生產(chǎn)批次的金沙牛化石片進行研究并得出其對照指紋圖譜，以期為該片劑的質(zhì)量控制以及生產(chǎn)加工提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AgiLent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，DAD檢測器，二元梯度泵)，軟件為chemstation色譜工作站；AgiLent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；SHIMADZU AUW120D電子天平(日本島津公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)。

1.2 試藥 夏佛塔苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111912-201302，含量92.5%)；金沙?；?每素片重0.25 g，東莞市中醫(yī)院醫(yī)院制劑)。

甲醇、乙腈為色譜純(美國默克公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流速1.0 mL·min-1；以乙腈為流動相 A，0.2%(體積分數(shù))磷酸的水溶液為流動相B，按表1程序進行梯度洗脫。檢測波長254 nm；柱溫25℃；進樣體積20 μL。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2 對照品溶液的制備 取夏佛塔苷對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加80%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為91.58 mg·L-1的對照品儲備液。精密移取對照品儲備液5 mL至10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得45.79 mg·L-1的對照品溶液。

2.3 金沙?；┰嚻啡芤褐苽?取金沙?；?0片，去除糖衣后，混勻，研細，取約10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中,加入 80%甲醇50 mL，稱定重量，水浴回流提取1 h，放冷，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批金沙牛化石片(批號:20140804)，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下色譜條件測定。以夏佛塔苷峰為參照，其保留時間和峰面積為1，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批金沙?；?批號:20140804)，分別于制備后0、2、4、8、16、24 h進樣，按“2.1”項下色譜條件測定。以夏佛塔苷峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復性試驗 取同一批金沙?；?批號:20140804)，分別精密稱取6份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。以夏佛塔苷峰為參照，其保留時間和峰面積為1，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果其RSD值均小于3%，表明本方法重復性良好。

2.5 金沙?；琀PLC指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰的標定 按“2.1”項下色譜條件進行測定，得到S1～S10供試品的HPLC指紋圖譜，根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對保留時間，確定共有峰，并選取18個共有峰作為特征指紋峰。以峰面積較大且穩(wěn)定，分離度好，出峰時間適中的13號峰作為參照峰，經(jīng)與夏佛塔苷對照品的出峰時間及紫外圖譜比對，確認13號峰為夏佛塔苷(廣金錢草中有效成分)，見圖1。以13號夏佛塔苷色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積值。

圖1 金沙牛化石片HPLC圖

2.5.2 指紋圖譜的相似度評價 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”對10批金沙?；琀PLC圖譜進行處理，匹配結(jié)果見圖2，所生成的對照圖譜見圖3。10批金沙?；c對照指紋圖譜的相似度分別為：0.921，0.983，0.955，0.983，0.931，0.950，0.981，0.977，0.970，0.968。

圖2 10批金沙?；?/p>

圖3 對照指紋圖譜匹配色譜圖

各批金沙?；c對照指紋圖譜的相似度均較高，為了保證金沙?；馁|(zhì)量，建議規(guī)定按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)計算，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度不得低于0.9。

3 討論

3.1 供試品溶液的制備 金沙牛化石片的制劑工藝中，除金沙牛、穿山甲、三七為細粉入藥，其余九味藥材均為水提取物入藥?？紤]到水提取物極性較大，本試驗選用了水、80%甲醇、甲醇作為溶媒比較提取效果，同時考察了超聲和水浴回流提取方式及提取時間的影響，結(jié)果以80%甲醇水浴回流提取1 h時指紋峰信息較為豐富且干擾較少。

3.2 檢測波長的選擇 比較254、272、300、330 nm波長時的色譜峰數(shù)目、響應強度、各峰之間的分離度，最終選用254 nm作為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 比較了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸4種洗脫體系，結(jié)果用乙腈-0.2%磷酸體系洗脫時，大多數(shù)峰的對稱性較好、理論塔板數(shù)較高，各峰之間的分離度較好，并且基線最為平穩(wěn)，因此最終選擇乙腈-0.2%磷酸作為流動相。

3.4 色譜柱篩選 嘗試了KromosiL C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Thermo HypersiL ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)及AgiLent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，分離情況無明顯差異，但使用ZORBAX SB-C18柱時峰形較好，且該色譜柱耐酸性較強，最終選用ZORBAX SB-C18色譜柱。

3.5 指紋圖譜分析 本實驗采用HPLC建立了金沙?；讣y圖譜分析方法，以13號夏佛塔苷峰為參照峰確認了金沙?；?8個共有峰，通過相似度評價軟件生成了10批金沙?；膶φ罩讣y圖譜，并計算出各批樣品與對照指紋圖譜之間的相似度。相比于單個主成分含量測定而言，指紋圖譜能從整體層面綜合反映中藥復方制劑的質(zhì)量，該方法可為金沙?；馁|(zhì)量評價及控制提供依據(jù)，有助于課題組后續(xù)開展譜效關(guān)系研究。

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HPLC fingerprint of jinshaniu huashi tablets

LIU Zai，PENG Zhanpeng，KUANG Huizhen，et al

(PharmaceuticalDepartment,DongguanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Dongguan,Guangdong523000,China)

Objective To establish HPLC fingerprints of jinshaniu huashi tablets,to provide basis for the scientific assessments of jinshaniu huashi tablets’ quality and stability of the production process.Methods The separation was performed on a ZORBAX SB-C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)with 0.2% phosphoric acid-acetonitrile as the mobile phase in a gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 254 nm,and the column temperature was set at 25 ℃.Fingerprint Similarity Evaluation Software(edition 2012)of Chinese Pharmacopoeia Commission was used to evaluate the similarity of the 10 batches of Jinshaniu Huashi Tablets.Results The common mode for the HPLC fingerprint was set up with schaftoside as the reference peak.Eighteen co-processing peaks were selected as the fingerprint peaks of jinshaniu huashi tablets.Good similarities with correlation coefficients higher than 0.9 were found between 10 batches of jinshaniu huashi tablets and the standard fingerpint.Conclusions The method is simple,accurate,and reproducible,which could be used for quality control of jinshaniu huashi tablets.

Jinshaniu huashi tablets;HPLC;Fingerprint

廣東省東莞市科技計劃項目(2003)

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.010

2016-06-24，

2016-08-11)