朱政怡 戚彤云 張 雪 柯越海 程洪強

骨架蛋白ENH在心血管系統(tǒng)中作用的研究進展

朱政怡 戚彤云 張 雪 柯越海 程洪強

ENH是一個含有PDZ和LIM結構域的骨架蛋白，存在多種mRNA剪接體，不同的剪接體具有不同的組織表達方式和功能。ENH在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮骨架蛋白的結構功能，在心臟發(fā)育和維持心臟Z線結構穩(wěn)定中有重要作用。ENH還能與不同的蛋白激酶結合，作為信號分子的錨定蛋白，調控信號轉導，調節(jié)心肌細胞的生長、血管平滑肌細胞的增殖與遷移。

心血管系統(tǒng)；ENH；骨架蛋白；錨定蛋白

心肌細胞與骨骼肌細胞是具有收縮功能的高度分化的肌細胞。肌小節(jié)是肌細胞結構與功能的最小單元。連接兩個相鄰肌小節(jié)的重要結構是Z線，由輔肌動蛋白α-Actinin-2以及與之結合的蛋白組成的蛋白復合體或蛋白質機器構成，在電鏡下為特征性的暗線。編碼Z線蛋白的基因突變是肥厚型和擴張型心肌病的主要遺傳因素。研究發(fā)現(xiàn)，Z線不僅維持肌小節(jié)結構穩(wěn)定，還是肌細胞感受力和傳遞信號的關鍵節(jié)點[1]。骨架蛋白ENH(Enigma homolog)與輔肌動蛋白結合，在肌細胞中主要位于肌小節(jié)的Z線[2]，與其他Z線蛋白相互作用維持Z線的穩(wěn)定，同時參與胞內信號的傳遞，是典型的Z線蛋白，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

1 ENH概述

ENH又名PDLIM5，屬于PDLIM蛋白家族[3-5]。PDLIM蛋白家族以含有PDZ和LIM結構域為特征，在哺乳動物中有10個編碼基因，根據蛋白結構特征可分成4個亞族。其中Enigma亞族包括Enigma、ENH和Cypher 3個基因，編碼的蛋白含有N端的PDZ結構域和C端的3個LIM結構域[5]。PDZ和LIM結構域的主要功能是參與蛋白間相互作用。PDZ結構域由80～100個氨基酸殘基組成，主要結合蛋白的疏水C末端。LIM是由大約55個氨基酸殘基組成的小結構域，含有半胱氨酸豐富的保守序列CX2CX16-23HX2CX2CX2CX16-21CX2(Cys/His/Asp)，與鋅離子(Zn2+)結合形成特殊雙鋅指結構，不與核酸分子結合，介導蛋白間相互作用[5]。ENH通過PDZ和LIM結構域與眾多蛋白相互作用，形成蛋白復合體，分別發(fā)揮細胞骨架和信號轉導作用。見表1。

表1 與ENH相互作用的蛋白列表

注：ENH 選擇性與PKCβ1、γ和ε結合，不與PKCα、δ和ξ結合；N/A為相互作用的結構域未進一步分析

2 ENH mRNA剪接

在哺乳動物中，大于95%的mRNA存在選擇性剪接，基因通過剪接可以產生多種蛋白[6]。ENH mRNA存在復雜的剪接，產生的蛋白可以分成兩組，含有3個LIM結構域的長剪接體和不含LIM結構域的短剪接體，長短剪接體又各自包含4～5種剪接體[7-8]。小鼠的ENH基因包含20個外顯子，外顯子1～3編碼N端PDZ結構域，外顯子17～20編碼C端的3個LIM結構域。外顯子5存在長(5)和短(5’)兩種形式，產生ENH1a(5)和ENH1b(5’)兩種產物，還可以與外顯子12～14組合產生3種不同剪接產物(ENH1c～ENH1e)。同樣，外顯子5和5’與外顯子6～8組合可產生4種ENH短剪接產物(ENH2、ENH3a、ENH3b和ENH4)。

ENH mRNA剪接有組織特異性，長剪接體在多種組織中表達，包括心臟、大腦、脾臟、肝臟和腎臟，而短剪接體只在心肌和骨骼肌中高表達[4, 9]。ENH mRNA剪接還與發(fā)育過程有關，在心臟和骨骼肌中，長剪接體是胚胎型，在胚胎中表達高，出生后逐漸降低；短剪接體是成體型，在胚胎中表達低，出生后逐漸升高[8, 10]。在骨骼肌細胞C2C12體外分化過程中，不同的ENH剪接體具有類似的表達模式[8, 11]。這種與發(fā)育相關的剪接模式在Enigma亞族的Cypher mRNA上也存在[12]。此外，ENH mRNA剪接還與疾病相關，在心肌肥厚小鼠心臟中，ENH mRNA剪接轉變成胚胎型，即長剪接體表達升高，短剪接體表達降低[10]。因此ENH剪接方式的變化可能參與心肌病的病理發(fā)生過程[13-14]。

3 ENH在心臟發(fā)育中的作用

心臟是胚胎早期發(fā)育并發(fā)揮功能的器官。ENH在小鼠胚胎發(fā)育早期的心臟區(qū)高表達[15]，可能是心臟發(fā)育早期重要轉錄因子Mesp1和Mef2A作用的結果[16-17]，表明ENH可能在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮作用。然而ENH基因敲除小鼠胚胎沒有明顯的心臟發(fā)育缺陷，推測是由于ENH同亞族的Cypher或Enigma發(fā)揮了替代作用[7]。與ENH相似，Cypher在小鼠心臟發(fā)育早期高表達，Cypher敲除小鼠也沒有明顯的發(fā)育缺陷[18]。而ENH/Cypher雙敲除小鼠在胚胎發(fā)育早期死亡，有明顯的心臟發(fā)育缺陷，包括心管擴張、心包積液、心室壁變薄以及心臟發(fā)育遲緩[15]，提示Enigma亞族的ENH與Cypher在心臟發(fā)育中確實存在功能上的冗余。在一項對室間隔缺損胎兒全基因組DNA甲基化修飾的分析中發(fā)現(xiàn)，室間隔缺損的胎兒ENH啟動子甲基化水平低，室間隔缺損與ENH的高表達有關[19]。

ENH的不同剪接體對心肌發(fā)育有不同的作用。體外研究發(fā)現(xiàn)ENH長剪接體(ENH1a)能增加肌細胞分化轉錄因子MyoD和Myogenin的表達，促進心肌細胞肥大，而短剪接體(ENH4)具有相反的作用，可抑制苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥大[11]。

4 ENH在維持心血管系統(tǒng)結構中的作用

免疫熒光染色顯示ENH主要分布在心肌細胞肌小節(jié)的Z線上，因此ENH可能與肌細胞的收縮相關。ENH敲除小鼠可出現(xiàn)擴張型心肌病，表現(xiàn)為左心室壁變薄、左心室腔增大、心臟收縮和射血功能減弱[7]。ENH敲除還會使小鼠心肌細胞的基因表達向胚胎型偏轉(如心房利鈉肽、B型利鈉肽、β肌球蛋白重鏈、骨骼肌肌動蛋白等表達升高)。ENH的缺失導致與其相互作用的Z線蛋白Calsarcin-1和Cypher短剪接體Cypher2c顯著減少。超顯微結構分析顯示ENH敲除小鼠肌小節(jié)Z線增寬，結構混亂。這些結果說明ENH參與維持心肌肌小節(jié)Z線結構的穩(wěn)定。

在壓力和損傷作用下，心臟會發(fā)生重構，表現(xiàn)為心肌纖維化和心肌細胞病理性生長，導致心力衰竭發(fā)生。心臟重構時，心臟成纖維細胞通過外泌體包裹的微小RNA-21(miR-21)作用于心肌細胞，降低miR-21靶標基因ENH的表達，誘導心肌病理性肥厚，提示ENH在維持心肌穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[20]。人類ENH的編碼基因是否存在與心肌病相關的突變及ENH在人類心血管結構中的作用尚不清楚。

5 ENH在心血管系統(tǒng)中的信號轉導作用

ENH在心血管系統(tǒng)中還發(fā)揮信號轉導作用。ENH是在尋找與蛋白激酶C(PKC)β1相互作用的新蛋白時被發(fā)現(xiàn)的，ENH的LIM結構域與PKCβ1的N端V1區(qū)結合，可被PKC磷酸化[4]。敲除ENH不影響心臟中PKC的表達[7]。在PKC的不同亞型中，ENH與PKCβ1、γ和ε結合，而不與PKCα、δ和ξ結合[4]。Enigma亞族的Cypher能與上述6種PKC亞型結合[21]，而Enigma只與PKCα、β1和ξ結合，說明Enigma亞族蛋白的LIM結構域都能與PKC結合，但通過結合不同的PKC亞型表現(xiàn)功能上的特異性。ENH可招募PKCβ1到細胞膜并增強其激酶活性，而不需要PKC的活化分子如二酰基甘油或者磷脂酰絲氨酸的參與[22]。Enigma亞族中Cypher和Enigma也具有相同的功能，但PDLIM蛋白家族中其他成員僅能與PKC結合，不具有活化PKC的功能。活化的PKC能夠直接磷酸化環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)，或者通過活化蛋白激酶D1(PKD1)，后者再磷酸化CREB[23]，磷酸化的CREB進入心肌細胞核發(fā)揮轉錄因子的功能，促進心肌細胞生長。這一過程是通過ENH的LIM結構域實現(xiàn)的，因此不含LIM結構域的ENH短剪接體不具有該功能，相反，ENH短剪接體可抑制PKC活化、CREB磷酸化以及心肌的病理性肥厚。

ENH還可與蛋白激酶A(PKA)和PKD相互作用[24-25]。ENH通過PDZ結構域結合心肌細胞L-型鈣離子通道(L-type calcium channel, LTCC)，協(xié)助PKD1或PKA磷酸化LTCC胞內段(如1928位點的絲氨酸殘基Ser1928)，調節(jié)細胞鈣流，參與腎上腺素能受體介導的增強心肌收縮的信號轉導。ENH在這方面的作用可能與Cypher存在重疊[24]。在對急性心肌梗死動物心臟的磷酸化蛋白質譜分析中發(fā)現(xiàn)，ENH和肌鈣蛋白I(cTnI)磷酸化水平顯著下降，其中，ENH的Ser118和cTnl的Ser22/23位點是PKA的作用位點[26]。ENH等肌纖維蛋白的磷酸化形式可能在維持心臟結構與信號轉導方面都發(fā)揮了重要作用。

除了心肌，ENH還在血管平滑肌中發(fā)揮重要的作用。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是細胞內的能量傳感器，通過調控微管和微絲的動態(tài)組裝過程調節(jié)細胞的極性形成和運動。在血管平滑肌細胞中，AMPK通過磷酸化ENH(Ser177)抑制Rac1的活性，下游分子Arp2/3蛋白隨之離開細胞片狀偽足前沿，破壞了應力纖維的組裝，抑制了偽足形成和細胞遷移[27]。ENH在肺動脈高壓患者和小鼠模型的肺動脈平滑肌中表達升高，降低ENH的表達會活化轉化生長因子β(TGFβ)的信號通路，促進肺動脈高壓的發(fā)生[28]。ENH可能成為肺動脈高壓治療的新靶點[29]。

6 結語

骨架蛋白ENH通過PDZ和LIM結構域與其它蛋白結合維持心肌細胞結構，尤其是心肌細胞在收縮過程中肌小節(jié)的結構。ENH還具有信號轉導方面的功能，可與蛋白激酶(PKA、PKC、PKD1和AMPK)及其底物直接作用，發(fā)揮錨定蛋白的功能，參與心肌細胞和血管平滑肌細胞的生長、增殖、分化和遷移。深入研究ENH在心血管系統(tǒng)中的作用，有助于設計與開發(fā)以骨架蛋白為靶點的新型心血管藥物。

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(收稿：2016-06-01 修回：2016-08-11)

(本文編輯：胡曉靜)

國家自然科學基金(81170117，31471258)

310058 杭州，浙江大學基礎醫(yī)學院病理與病理生理學系

程洪強，Email：hqcheng11@zju.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.06.009