朱桂平 張 莉 周玉良 李博維 林忠偉 雷 達
外源性睪酮對雄性小鼠心功能和心臟衰老的影響
朱桂平 張 莉 周玉良 李博維 林忠偉 雷 達
目的:探討外源性睪酮對雄性小鼠心功能和心臟衰老的影響。 方法:15個月齡C57/BL6雄性小鼠分為4組:安慰劑組、睪酮組、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)抑制劑EX-527組(EX-527組)和睪酮+EX-527組,每組7只。干預(yù)3個月后超聲心動圖檢測小鼠心功能指標,ELISA法檢測小鼠血清睪酮濃度,分離小鼠左心室,組織化學染色法檢測衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal),Western blot檢測心肌組織B型利鈉肽(BNP)、Sirt1蛋白表達水平,實時定量RT-PCR檢測心肌組織肌球蛋白重鏈(MYH)6、MYH7、肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2(SERCA2)和α-肌動蛋白1(ACTA1) mRNA表達水平。 結(jié)果:睪酮組及睪酮+EX-527組血清睪酮水平較安慰劑組及EX-527組明顯升高(P均<0.05)。與安慰劑組相比,睪酮組SA-β-gal染色陽性面積比例明顯減少[(17.13±7.12)%對(35.88±10.74)%,P<0.05],BNP蛋白表達水平、MYH7和ACTA1 mRNA表達水平明顯降低(P均<0.05),Sirt1蛋白表達水平、MYH6和SERCA2 mRNA表達水平明顯升高(P均<0.05)。EX-527組和睪酮+EX-527組上述各指標與安慰劑組相比無統(tǒng)計學差異,與睪酮組相比有顯著性差異(P均<0.05)。超聲心動圖結(jié)果示各組左室舒張末期內(nèi)徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、左室縮短分數(shù)、左室射血分數(shù)及E/A值無顯著性差異(P均>0.05)。 結(jié)論:外源性睪酮可能通過Sirt1途徑延緩雄性小鼠心肌細胞衰老,改善心衰相關(guān)的基因表達異常。
衰老;睪酮;心功能不全;沉默信息調(diào)節(jié)因子1
心臟是雄激素作用的靶器官之一,總睪酮或游離睪酮水平降低與充血性心力衰竭死亡率增加有關(guān)[1],睪酮治療已作為心力衰竭(心衰)可選擇的治療措施[2]。心肌細胞衰老可導致心衰的發(fā)生發(fā)展[3-4],我們前期研究發(fā)現(xiàn)低睪酮水平可誘導心肌細胞衰老,睪酮替代治療可延緩心肌細胞衰老[5]。本研究通過體內(nèi)實驗,探討外源性睪酮對雄性小鼠心功能和心臟衰老的影響。
1.1 實驗動物及分組
15個月齡C57/BL6雄性小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗共分4組,每組7只小鼠,SPF條件下分籠飼養(yǎng)。(1)安慰劑組:小鼠肌肉注射芝麻油;(2)睪酮組:小鼠每3 d肌肉注射3 mg/kg丙酸睪酮[5];(3)EX-527組:小鼠每3 d腹腔內(nèi)注射10 mg/kg沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)抑制劑EX-527;(4)睪酮+EX-527組:小鼠肌肉注射丙酸睪酮聯(lián)合腹腔內(nèi)注射EX-527。各組干預(yù)時間均為3個月。
1.2 超聲心動圖檢測
采用腹腔內(nèi)注射1.5%戊巴比妥鈉對小鼠進行全身麻醉。左前胸脫毛后,左側(cè)臥位固定于溫度恒定的操作臺上,心率控制在400~500次/min。使用美國GE公司Vivid-7超聲儀,30MHz探頭行超聲心動圖分析,顯示胸骨旁左室長軸切面,由二維B型超聲測量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、室間隔厚度(IVST)和左室后壁厚度(PWT),并計算左室縮短分數(shù)(LVFS)和左室射血分數(shù)(LVEF)。由心尖四腔切面獲得二尖瓣舒張早期最大峰值速度(E峰)和舒張晚期最大峰值速度(A峰),計算E/A值。
各組小鼠在干預(yù)及處死前于上午9至11時之間眼球取血,靜置30 min后,3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min,取血清,ELISA法測定睪酮濃度(試劑盒購自R&D公司)。
1.4 組織化學染色法檢測衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)
小鼠腹腔內(nèi)注射肝素5 000 U/kg,20 min后行頸椎脫臼法處死小鼠,迅速開胸摘取心臟。37℃ PBS緩沖液中分離左心室心肌組織,去除血液及脂肪組織。心肌組織石蠟包埋、切片,常規(guī)脫蠟后,根據(jù)SA-β-gal染色試劑盒(上海碧云天公司)說明書對心肌組織進行SA-β-gal染色,顯微鏡下觀察組織染色,每組選取3張心肌組織石蠟切片,用Image-Pro Plus 6.0軟件計算每張切片的藍染面積和總面積,其比值為藍染陽性面積比例。
1.5 Western blot檢測
蛋白提取液提取左心室心肌組織蛋白,BCA法測定蛋白濃度。各組均取20 μg蛋白樣品,凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后,室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,加入Sirt1抗體(1∶2 000,abcam公司)、B型利鈉肽(BNP)抗體(1∶500,Santa Cruz公司)、GAPDH抗體(1∶5 000,Sigma公司),4℃孵育過夜,洗膜后與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000,Invitrogen公司)室溫下孵育1 h,洗膜后ECL顯影,X線膠片曝光,以目的條帶和GAPDH條帶吸光度的比值代表蛋白的相對表達量。
1.6 實時定量PT-PCR檢測“胎兒”基因表達水平
RNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取左心室心肌組織總RNA,分光光度計測定RNA濃度。500 ng RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green I染料(Invitrogen公司)進行定時定量PCR,分析肌球蛋白重鏈(MYH)6、MYH7、肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2(SERCA2)和α-肌動蛋白1(ACTA1)mRNA表達水平,H1F0作為內(nèi)參基因。引物序列如下,MYH6正義序列為5′-TGAGACGGTGGTGGGTTTGT-3′,反義序列為5′-CACCGGTATCAGCAGAAGCATA-3′;MYH7正義序列為5′-TCCTCACATCTTCTCCATCTCT GA-3′,反義序列為5′-TGGACTGATTCTCCCGA TCTG-3′;SERCA2正義序列為5′-CTCTGGAG TTTTCACGGGATAGAA-3′,反義序列為5′-TCC GGCTTGGCTTGTTTG-3′;ACTA-1 正義序列為5′-TCGCTGACCGCATGCA-3′,反義序列為5′-GG GCGATGATCTTGATCTTCA-3′;H1F0正義序列為5′-AGCCACTACAAGGTGGGTGAGA-3′,反義序列為5′-TTGAGAACACCGGTGGTCACT-3′。擴增條件為:95℃預(yù)變性10 min,然后進行40個循環(huán),包括95℃變性15 s,60℃退火1 min。計算以H1F0為對照的mRNA相對表達量,安慰劑組設(shè)為參考mRNA,其相對表達量為100。
1.7 統(tǒng)計學分析
學者詹姆斯·韋伯·揚曾認為,創(chuàng)意就是“舊元素的新組合”。像案例中的“足球高爾夫”、“地排球”、“嗒嗒球”屬于不同元素重組的體育參與方式轉(zhuǎn)型范疇,即“將單一元素重組成多元元素融合”、“將傳統(tǒng)元素重組成現(xiàn)代元素”、“將傳統(tǒng)項目重組成新鮮項目”等,改變了一些傳統(tǒng)的體育項目因沒有新鮮感或因難度過高不能滿足群眾多元需求的現(xiàn)狀,吸收了新鮮有趣、入門容易或驚險刺激的項目元素特點,充分彰顯了人與生俱來的創(chuàng)意智慧。因此,需要元素重組開發(fā)新項目,以滿足群眾參與體育運動的欲望,實現(xiàn)體育項目元素與活動內(nèi)容的多元化,體現(xiàn)傳統(tǒng)與現(xiàn)代氣息的融合。
采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示。各組間比較采用單因素方差分析法,組間多重比較方差齊時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett′s T3法,以P<0.05為有統(tǒng)計學差異。
2.1 各組小鼠超聲心動圖結(jié)果
超聲心動圖檢查結(jié)果示各組間LVEDd、IVST、PWT、LVFS、LVEF、E/A值未見顯著性差異(P均>0.05,見表1)。
2.2 各組小鼠血清睪酮水平
干預(yù)3個月后,睪酮組及睪酮+EX-527組血清睪酮水平分別為(19.27±3.22) nmol/L和(22.09±4.06) nmol/L,較安慰劑組[(5.26±1.39) nmol/L]和EX-527組[(3.99±1.06) nmol/L]均明顯升高(P均<0.05);睪酮組與睪酮+EX-527組血清睪酮水平無明顯差異;EX-527組與安慰劑組血清睪酮水平無明顯差異。
2.3 各組小鼠心肌組織SA-β-gal化學染色陽性面積比例
SA-β-gal染色后,心肌組織可見胞漿和胞核呈藍染(見圖1)。對各組藍染陽性面積比例進行計算,睪酮組SA-β-gal 藍染陽性面積比例與安慰劑組相比明顯減少[(17.13±7.12)%對 (35.88±10.74)%,P<0.05];EX-527組和睪酮+EX-527組藍染陽性面積比例分別為(30.51±10.12)%和(28.21±3.60)%,與睪酮組相比明顯增加(P均<0.05);安慰劑組、EX-527組與睪酮+EX-527組之間藍染陽性面積比例無統(tǒng)計學差異。
2.3 各組小鼠心肌組織Sirt1、BNP蛋白表達水平
與安慰劑組相比,睪酮組心肌組織Sirt1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05),BNP蛋白表達水平明顯降低(P<0.05);與睪酮組相比,EX-527組和睪酮+EX-572組Sirt1蛋白表達水平明顯降低(P均<0.05),BNP蛋白表達水平明顯升高(P均<0.05);安慰劑組、EX-527組、睪酮+EX-527組之間Sirt1和BNP蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異。見圖2、表2。
表1 各組小鼠超聲心動圖檢測結(jié)果
圖1 各組小鼠心肌組織衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶化學染色(×20)
2.4 各組小鼠心肌組織“胎兒”基因mRNA表達水平
與安慰劑組相比,睪酮組MYH6和SERCA2 mRNA表達水平明顯升高(P均<0.05),MYH7和ACTA1 mRNA表達水平明顯降低(P均<0.05);與睪酮組相比,EX-527組和睪酮+EX-572組MYH6和SERCA2 mRNA表達水平明顯降低(P均<0.05),MYH7和ACTA1 mRNA表達水平明顯升高(P均<0.05);安慰劑組、EX-527組、睪酮+EX-527組之間上述“胎兒”基因表達水平無統(tǒng)計學差異。見表3。
圖2 各組小鼠心肌組織Sirt1和BNP蛋白表達水平
安慰劑組睪酮組EX?527組睪酮+EX?527組SIRT10.25±0.090.63±0.06(1)0.37±0.04(2)0.32±0.07(2)BNP0.79±0.150.41±0.08(1)0.74±0.12(2)0.65±0.06(2)
注:與安慰劑組相比,(1)P<0.05;與睪酮組相比,(2)P<0.05
表3 各組小鼠心肌組織“胎兒”基因mRNA相對表達水平的比較
注:與安慰劑組相比,(1)P<0.05;與睪酮組相比,(2)P<0.05
睪酮水平降低與衰老的許多病理狀態(tài)如性功能障礙、內(nèi)臟性肥胖、骨骼和肌肉強度減弱及情緒障礙等相關(guān)[6-7]。邊甌等[8]研究顯示,高齡男性慢性心衰患者中,發(fā)生2型心腎綜合征的患者血清睪酮水平降低,可出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能不全、腎動脈硬化和腎臟纖維化。睪酮治療可改善老年及去勢C57BL/6小鼠的腦衰老[9],抑制快速老化模型SAMP8小鼠海馬區(qū)血管內(nèi)皮細胞衰老[10]。本研究中睪酮組及睪酮+EX-527組血清睪酮水平較安慰劑組和EX-527組均明顯升高,提示外源性睪酮治療后可使小鼠血清睪酮水平升高。SA-β-gal是衰老細胞的特異性標志物,本研究中睪酮組與安慰劑組相比,心肌組織SA-β-gal藍染陽性面積比例減少,提示外源性睪酮治療可延緩心肌組織衰老。
心衰患者血漿睪酮水平下降[11],尤其是老年患者。Pugh等[12]對20例男性心衰患者的研究中發(fā)現(xiàn),12周的睪酮治療能明顯改善患者的生活質(zhì)量和心衰相關(guān)的臨床癥狀。給予76例中重度心衰患者生理劑量睪酮治療12個月,可使患者運動耐量和心衰癥狀明顯改善[2]。但對于老年男性,睪酮替代治療糾正心衰是否通過延緩心臟衰老來實現(xiàn)尚不明確。
心肌細胞衰老時,心肌僵硬度增加,收縮與舒張功能下降,其發(fā)生與“胎兒”基因表達改變有關(guān),表現(xiàn)為MYH6向MYH7轉(zhuǎn)化、SERCA2表達下降和ACTA1表達增加[13]。這些“胎兒”基因的表達改變同時是成人心衰的典型表現(xiàn),且心肌細胞損傷及功能障礙時還可出現(xiàn)BNP表達異常。本研究發(fā)現(xiàn)睪酮治療可改善衰老心肌組織中“胎兒”基因的表達改變,下調(diào)BNP表達水平,提示睪酮治療可能通過延緩心肌細胞衰老,改善心功能。
心臟衰老時,超聲心動圖無特異性改變。心肌細胞衰老可導致左室舒張末期壓力升高,舒張早期充盈速度下降,表現(xiàn)為E/A值下降[5]。外源性睪酮治療對超聲心動圖指標的影響,目前的研究結(jié)果不盡一致。有研究顯示,外源性睪酮可改善去勢大鼠LVEDd和LVEDs的增加[14]及EF、左心室形成壓(LVDP)和左心室壓力最大上升速率 (±dp/dtmax)的下降[11,15]。本研究顯示,與安慰劑組相比,睪酮治療后LVEDd、IVST、PWT、LVFS、LVEF、E/A均未見顯著性差異。雖然本研究提示睪酮治療可明顯改善心衰相關(guān)的基因異常,但并未發(fā)現(xiàn)睪酮能夠改善與心衰相關(guān)的心臟結(jié)構(gòu),與其他研究不一致的原因可能為衰老程度尚不足以引起小鼠心臟結(jié)構(gòu)變化、樣本量少、治療周期短等。
Sirt1的表達增加可改善衰老相關(guān)的心肌肥大、凋亡及心功能不全,使衰老相關(guān)標志物表達下調(diào)[16]。心臟局部分泌的胰島素生長因子對氧化應(yīng)激引起的心肌細胞損害具有保護作用,可調(diào)節(jié)心肌細胞衰老,而這一作用由Sirt1介導[15]。Kataoka等[17]研究發(fā)現(xiàn)皮下注射睪酮可增加大鼠海綿體Sirt1 mRNA的表達。Ota等[10]也發(fā)現(xiàn)睪酮干預(yù)可增加血管內(nèi)皮細胞Sirt1的表達;而Sirt1小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染或Sirt1抑制劑預(yù)處理內(nèi)皮細胞可抑制睪酮延緩細胞衰老的作用,提示睪酮通過Sirt1途徑延緩血管內(nèi)皮細胞衰老。目前尚無心肌細胞中睪酮與Sirt1關(guān)系的研究。本研究發(fā)現(xiàn),睪酮組心肌組織Sirt1表達水平較安慰劑組明顯上調(diào),抑制Sirt1可拮抗睪酮減少SA-β-gal藍染陽性面積比例的作用,并抑制睪酮對“胎兒”基因及BNP表達的作用,提示睪酮延緩心肌細胞衰老、改善心臟功能的作用可能是通過Sirt1途徑來實現(xiàn)的。
綜上所述,睪酮可能通過Sirt1途徑延緩雄性小鼠心肌細胞衰老,改善心衰相關(guān)的基因表達異常。進一步通過體內(nèi)及體外實驗探討其分子學機制對研究衰老相關(guān)的心臟疾病具有重要意義。
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(收稿:2016-05-19 修回:2016-09-11)
(本文編輯:胡曉靜)
The effects of exogenous testosterone on cardiac function and myocardial senescence in male mice
ZHUGuiping,ZHANGLi,ZHOUYuliang,LIBowei,LINZhongwei,LEIDa.
DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangdong510080,China
Objective:To investigate the effects of exogenous testosterone on cardiac function and myocardial senescence in male mice. Methods:Twenty-eight 15-month-old male C57/BL6 mice were divided into 4 experimental groups: placebo group, testosterone group, silent information regulator 1 (SIRT1) inhibitor EX-527 group (EX-527 group) and testosterone+EX-527 group. Echocardiography was performed under anesthesia after treatment for 3 months. ELISA was used to detect the serum concentration of testosterone. Senescence associated β galactosidase (SA-β-gal) of left ventricular myocardium was measured by histochemical staining. Western blot was used to estimate the protein expression of B-type natriuretic peptide (BNP) and Sirt1, while real-time RT-PCR was used to assay the mRNA expression of myosin heavy chain (MYH)6、 MYH7、sarcoendoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2 (SERCA2) and α-skeletal actin (ACTA1). Results:Serum testosterone levels in testosterone group and testosterone+EX-527 group were significantly higher than those in placebo group and EX-527 group (allP<0.05). Compared with the placebo group, the proportion of SA-β-gal positive areas, protein expression of BNP, and mRNA expression of MYH7 and ACTA1 were significantly decreased, while the protein expression of Sirt1, and mRNA expression of MYH6 and SERCA2 were significantly increased in testosterone group (allP<0.05). These indexes in both EX-527 group and testosterone+EX-527 group had no significant difference as compared with placebo group, but had significant differences as compared with testosterone group (P<0.05). Echocardiography results such as left ventricular end diastolic diameter (LVEDd), interventricular septal thickness (IVST), posterior wall thickness (PWT), left ventricular fractional shortening (LVFS)、left ventricular ejection fractions (LVEF) and E/A value had no significant difference in each gourp (allP>0.05). Conclusion:Exogenous testosterone may retard the process of myocardial senescence and ameliorate the gene expression associsted with cardiac dysfunction in male mice by Sirt1 pathway.
Senescence; Testosterone; Cardiac dysfunction; Silent information regulator 1
廣東省公益研究與能力建設(shè)專項資金(2014A020212305);廣東藥學院附屬第一醫(yī)院院內(nèi)課題
510080 廣州,廣東藥學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科
雷 達,Email:gyleida@163.com
10.3969/j.issn.1673-6583.2016.06.014