胡倩影，丁艷，田己鑫，梁曉煒，李 欽

河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004

桃葉珊瑚苷抗皮膚光老化作用機(jī)制研究

河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004

〔目的〕探索桃葉珊瑚苷 (aucubin，AU) 抗皮膚光老化作用機(jī)制。 〔方法〕 采用UVA+UVB光源照射小鼠背部皮膚，建立小鼠皮膚光老化模型。將60只昆明種小鼠隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、維生素E陽性對照組 (VE組，10 mg/100 mL)、AU高 (10 mg/100 mL)、中 (5 mg/100 mL)、低(0.5 mg/100 mL)劑量組。除正常組外，其余各組每日均采用UVA+UVB紫外線照射并皮膚涂布給藥，連續(xù)8周，第9周將小鼠斷頸處死，取小鼠光照部位皮膚，HE染色，觀察皮膚組織結(jié)構(gòu)變化；比色法檢測小鼠皮膚中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性和總抗氧化能力(T-AOC)；氨基酸分析法測定小鼠皮膚中羥脯氨酸(HYP)含量；ELISA法測定膠原蛋白Ι (Collagen I) 含量。〔結(jié)果〕 與模型組比較，AU高劑量組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)受損程度明顯減輕，結(jié)構(gòu)比較完整、厚薄均一，細(xì)胞分層清晰，真皮層可見豐富的膠原纖維組織，分布均勻、排列有序；SOD、MDA、T-AOC含量變化不明顯；小鼠皮膚中HYP、Collagen I和總氨基酸(AA)的含量明顯升高,幾乎接近正常健康小鼠的水平?！步Y(jié)論〕桃葉珊瑚苷具有抗皮膚光老化的作用，其作用機(jī)制與促進(jìn)膠原蛋白的合成有關(guān)。

桃葉珊瑚苷；抗皮膚光老化；膠原蛋白

皮膚老化主要分為自然老化和光老化兩種形式。皮膚光老化主要是因環(huán)境引起的，光老化能夠?qū)е聡?yán)重的皮膚問題，并與多種皮膚病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，因而近年來皮膚光老化的問題受到了很多研究學(xué)者的關(guān)注。光老化皮膚表現(xiàn)為皮膚表皮增厚，真表皮連接變平，表皮細(xì)胞極性消失，形態(tài)不典型。真皮成纖維細(xì)胞增大、增多，大量炎癥細(xì)胞浸潤，彈性纖維增多、增粗、排列紊亂，而膠原纖維變少。皮膚中75%由膠原蛋白組成，膠原蛋白維持著皮膚的彈性和水潤[1-3]，因此，皮膚中膠原蛋白的含量是皮膚衰老的重要指標(biāo)。皮膚中的羥脯氨酸含量相對穩(wěn)定，約占膠原蛋白總量的13%，可直接反應(yīng)真皮內(nèi)膠原纖維的含量變化，從而能夠反應(yīng)真皮衰老的程度，所以其含量變化也可以作為判定皮膚衰老程度的一個敏感指標(biāo)[4]。

課題組前期研究[5]表明，在光老化模型小鼠中，杜仲環(huán)烯醚萜類提取物，能夠明顯改善小鼠皮膚的皮膚組織的光老化形態(tài)，減輕小鼠皮膚皺紋，改善皮膚的結(jié)構(gòu)，提高真皮層膠原纖維的含量；提高小鼠皮膚的含水量；提高小鼠皮膚組織中SOD活力和T-AOC能力，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的堆積，有效地清除自由基及活性氧。我們實驗在前期體活性部位篩選的基礎(chǔ)上，選擇了杜仲中含量較大的環(huán)烯醚萜類化合物-桃葉珊瑚苷，進(jìn)行抗皮膚光老化實驗，探討桃葉珊瑚苷抗皮膚光老化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗用動物

昆明種小鼠60只(批號：1019052，合格證號：SCXK(豫)2010-0002)，體重(18～22)g，雌雄各半，購于河南省實驗動物中心。環(huán)境溫度控制在(25 ± 2)℃，光照時間12 h，動物自由攝食飲水。

1.2 試劑與藥品

桃葉珊瑚苷實驗室自制(純度>98%)，維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)，蘇木素染液(蘇寧食藥監(jiān)械)，中性膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，SOD、MDA和T-AOC試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠皮膚膠原蛋白Ι試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器及設(shè)備

氨基酸分析儀(A3100，德國曼默波爾公司)，生物顯微鏡(BA410，廈門 MOTIC公司)，全波長酶標(biāo)儀(Power Wave XS sn208527，美國Bio-Tek公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥 將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為：正常組(不做任何處理)，模型對照組(涂抹體積分?jǐn)?shù)30%甘油水溶液，每次涂抹體積為0.5 mL)，陽性對照組(維生素E)，桃葉珊瑚苷高、中、低劑量組。自由飲水、進(jìn)食，飼養(yǎng)1周適應(yīng)實驗室環(huán)境后開始進(jìn)行實驗。

1.4.2 小鼠皮膚光老化模型的建立 UVB 燈管1根(光譜集中在320 nm)，UVA 燈管1根(光譜集中在340 nm)，并列穿插安裝到自制模擬日光箱中。每只小鼠均用脫毛膏脫出小鼠背部2.0 cm×2.0 cm區(qū)域內(nèi)毛發(fā)(實驗過程中隔日脫毛1次)。除正常組外，其他各組鼠籠籠蓋移除后，放入自制照射箱中，距離光源30 cm 處。第1周開始每天照射20 min，第2～4周每天照射30 min，第5～8周每天照射40 min。照射以5 d為1個周期，間隔2 d，再開始下一個周期，至8周結(jié)束后終止UV暴露。造模過程中每天觀察動物背部皮膚有無水皰或糜爛等情況，如果出現(xiàn)上述癥狀，立即停止照射2～3 d，至上述癥狀消失后再繼續(xù)照射，直至造模成功。

1.4.3 取材 第8周結(jié)束后，全部小鼠斷頸處死，取下背部脫毛區(qū)皮膚(不含皮下脂肪組織)，用冰生理鹽水漂洗干凈，去除血液，濾紙拭干，稱重，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 小鼠背部皮膚的宏觀評價 觀察小鼠皮毛光澤，皮膚硬度和皺紋。

1.4.5 皮膚組織學(xué)觀察 將皮膚組織切片固定于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛 24 h后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm的組織切片。對切片分別經(jīng)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

1.4.6 組織勻漿的制備 每個小鼠皮膚組織標(biāo)本取0.3 g，用手術(shù)剪將皮膚組織塊剪碎后倒入玻璃勻漿管中，量取1.2 mL冷生理鹽水，倒入勻漿器中使組織勻漿化，勻漿液4 000 r/min，離心15 min，取上清液。

1.5 統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

2.1 AU對UV照射小鼠皮膚宏觀表現(xiàn)的影響

正常組小鼠實驗全程皮膚無明顯改變，皮毛有光澤，活潑喜動，食欲佳，食量正常，體重平穩(wěn)增加。模型組小鼠在8周實驗結(jié)束時，皮毛光澤度下降，皮膚顏色加深，表皮增厚，干燥粗糙，彈性喪失，皮膚紋理增寬加深。與模型組小鼠比較，AU高劑量組能明顯改善小鼠背部皮膚顏色，表皮增厚和皺紋加深現(xiàn)象也得到改善。VE組雖然也能改善上述癥狀，但效果不明顯。結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠皮膚一般形態(tài)觀察

2.2 AU對UV照射小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)的影響

常規(guī)HE染色后，正常組小鼠，皮膚表皮組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞分層清晰、厚度正常、具有明顯的表皮突及真皮乳頭；真皮層可見纖維組織、分布均勻、排列有序、疏密有致、細(xì)胞成分及數(shù)量適中。與正常組小鼠相比，模型組小鼠的表皮組織結(jié)構(gòu)不完整，分層不清楚；因真皮層成纖維組織發(fā)生變性，導(dǎo)致真皮組織排列紊亂、分布不均勻。與模型組相比，AU高劑量組小鼠表皮組織結(jié)構(gòu)受損程度明顯減輕，結(jié)構(gòu)比較完整、厚薄均一、細(xì)胞分層比較清晰；真皮層可見纖維組織，且分布較為均勻、排列有序，膠原纖維比較豐富。作為陽性對照的VE組，小鼠皮膚膠原纖維增加不明顯。結(jié)果見圖2。

圖2 小鼠皮膚病理切片

2.3 AU對小鼠各生化指標(biāo)的影響

2.3.1 AU對UV照射小鼠皮膚含水量的影響 用水分測定儀分別測量小鼠背部皮膚含水量,每次間隔4周。結(jié)果如表1。為避免儀器和操作帶來的誤差，每只小鼠測量3次，取3次測量平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。第一次測定時間為造模前，各組小鼠皮膚含水量無顯著性差異(P>0.05)；第二次測定時間為紫外照射4周后，發(fā)現(xiàn)各組小鼠皮膚水分與照射前相比均有明顯下降，且差異具有顯著性(P<0.01)，說明紫外線照射能降低小鼠皮膚的水分，但是在第8周第三次測定(實驗結(jié)束)時，發(fā)現(xiàn)AU高劑量組水分值幾乎恢復(fù)到了造模前，VE組水分值也有所恢復(fù)，而模型組含水量卻持續(xù)降低。將AU高劑量組水分值和模型組小鼠皮膚水分值對比發(fā)現(xiàn)，AU高劑量組的水分明顯高于模型組小鼠的皮膚含水量，且差異具有顯著性(P<0.01)，VE組和模型組比較也有顯著性差異(P<0.01)。同時比較模型組和空白組小鼠的皮膚水分含量，雖然發(fā)現(xiàn)模型組和正常組皮膚含水量在整個實驗過程中均持續(xù)降低，但是模型組的水分值明顯低于正常組，且差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

2.3.2 小鼠皮膚中抗氧化活性(SOD、MDA和T-AOC)檢測 模型組小鼠皮膚中SOD和T-AOC活力比正常組低，MDA含量升高，且差異顯著，說明紫外線照射能引起小鼠皮膚氧化性損傷。VE組和模型組相比，SOD，T-AOC活力升高，MDA含量降低，具有極顯著性差異(P<0.01)。說明VE能抵抗紫外線引起的小鼠皮膚氧化性損傷。AU各劑量組和模型組的抗氧化能力相比，雖有提高但不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明化合物AU的抗氧化活性不顯著。

2.3.3 小鼠皮膚中HYP和AA含量測定 經(jīng)過8周實驗后，模型組和正常組相比HYP和AA的含量均有所降低，且差異極顯著(P<0.01)，說明紫外線照射能明顯減少小鼠皮膚細(xì)胞羥脯氨酸的分泌。與模型組相比，AU高、中劑量組及陽性對照VE組，小鼠皮膚HYP和AA含量明顯增加，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果見表2。

圖3 各組小鼠皮膚水分3次測定結(jié)果比較注：$$表示與第一次水分測定值比較有極顯著性差異(P<0.01)，#表示與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，**表示與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01)

組別動物/只SOD(nmoL/mgProt)MDA(nmoL/mg)T?AOC(nmoL/mgProt)正常組1037．71±6．392．8±0．0827．93±0．84模型組1032．77±1．84#3．54±0．1#22．63±0．95#VE組1042．97±2．15??1．22±0．12??28．42±1．08??AU高劑量組1034．29±3．851．26±0．0925．65±1．76AU中劑量組1034．05±2．922．02±0．0717．95±2．01AU低劑量組1023．63±3．783．38±0．1315．29±2．45

注：#表示與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，**表示與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01)。

表2 小鼠皮膚中羥脯氨酸及總氨基酸的含量(μg/100 g)

注：##表示與正常組比較有極顯著性差異(P<0.01),**表示與模型組比較有極顯著性差異 (P<0.01)。

2.3.4 小鼠皮膚Collagen I含量測定 經(jīng)8周實驗后，模型組小鼠皮膚Collagen I含量明顯下降，與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)，說明紫外線照射能減少小鼠皮膚中膠原蛋白的合成。與模型組相比，AU高劑量組小鼠皮膚Collagen I含量明顯增加，且具有顯著性差異(P<0.01)。中、低劑量組小鼠皮膚Collagen I含量增加不顯著。VE組對小鼠皮膚Collagen I有促進(jìn)作用(P<0.05)，但不及AU高劑量組顯著。結(jié)果見表3。

表3 小鼠皮膚中膠原蛋白 Ι 的含量(μg/100 g)

注：#表示與正常組比較有顯著性差異(P<0.05),*表示與模型組比較有顯著性差異 (P<0.05),**表示與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01)。

3 討論

引起皮膚衰老的原因可能有多種，我們實驗從影響衰老最主要的4個方面，即皮膚的狀態(tài)；皮膚保持水分的能力；機(jī)體的抗氧化、清除自由基的能力；皮膚膠原蛋白的含量，比較AU對光老化模型小鼠皮膚衰老的影響。

皮膚的狀態(tài)往往作為估價機(jī)體年齡的第一個指標(biāo)[6]。我們實驗中，紫外線照射可使小鼠皮膚表皮增厚，出現(xiàn)真表皮連接變平，表皮細(xì)胞極性消失，形態(tài)不典型。彈性纖維增多、增粗、排列紊亂，膠原纖維變少，分布異常，使小鼠皮膚出現(xiàn)光老化的典型特征。AU高劑量組能明顯改善小鼠皮膚的上述癥狀。皮膚水分大量丟失，導(dǎo)致皮膚干燥，萎癟，缺乏彈性，出現(xiàn)皺紋，皮膚老化，因此皮膚含水量與皮膚衰老密切相關(guān)。通過測定皮膚水分的含量，也可間接反映皮膚衰老的程度[7]。 紫外線照射后，模型組小鼠的皮膚水分含量持續(xù)降低，而AU高劑量組使小鼠皮膚水分含量先降后升，達(dá)到抗小鼠皮膚光老化的作用。

現(xiàn)代研究[8-10]表明SOD、MDA 和脂褐素(LPf) 等是直接關(guān)系生物體內(nèi)“氧化”損害與“抗氧化”的相關(guān)指標(biāo)，而它們有可能是引起或延緩諸如皮膚衰老、皮膚褐斑的關(guān)鍵因素。經(jīng)紫外線照射8周后，小鼠皮膚組織中SOD、T-AOC活性下降，MDA含量升高，說明小鼠皮膚發(fā)生了光老化。AU高劑量組可對抗紫外線造成的皮膚光損傷，使小鼠皮膚組織中的SOD，T-AOC活力略有提高，MDA含量略有降低，具有一定的抗氧化損傷作用，因此能在一定程度預(yù)防小鼠皮膚的光老化，但是抗氧化活性效果遠(yuǎn)不及同濃度的VE組。

膠原蛋白是皮膚蛋白的主要成分，約占總蛋白的60%左右，皮膚的生長、營養(yǎng)和修復(fù)都離不開膠原蛋白。隨著年齡增長，皮膚膠原產(chǎn)物減少，因此檢測膠原蛋白的變化可反映皮膚衰老的狀況[11]。HYP 是皮膚膠原蛋白中一種主要且相對恒定的非必需氨基酸，其量已成為檢測機(jī)體膠原代謝的重要指標(biāo)，也是衡量皮膚衰老的指標(biāo)之一[12]。我們實驗結(jié)果表明，紫外線照射后，模型組小鼠皮膚組織中HYP、AA和Collagen I含量與正常組相比明顯降低，具有顯著性差異(P<0.05)，說明紫外線照射能明顯減少小鼠皮膚成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的含量。AU高劑量組能明顯提高小鼠皮膚中HYP、AA和Collagen I含量，且具有極顯著性差異(P<0.01)，說明AU高劑量組能促進(jìn)小鼠皮膚膠原蛋白的合成，增加羥脯氨酸的含量，達(dá)到抗皮膚光老化的作用。

我們通過組織學(xué)和小鼠皮膚系列生化指標(biāo)的測定，說明一定劑量的桃葉珊瑚苷能增加光老化模型小鼠皮膚膠原的厚度,使膠原纖維的排列更為致密，提高皮膚的含水量，增加膠原蛋白的含量，但是其抗氧化能力作用較弱。初步證實了桃葉珊瑚苷可能是通過刺激皮膚膠原蛋白的合成達(dá)到抗皮膚光老化的作用。

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[責(zé)任編輯 李武營]

Study on the mechanism of anti-skin photoaging of aucubin

Henan University College Pharmacy, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕The anti-skin photoaging effects of aucubin(AU) were investigated in this paper.〔Methods〕 The anti-photoaging effects of AU were investigated using a skin photoaging model, which was prepared using an ultraviolet UVA and UVB light source to irradiate the back skin of mice. Sixty rats were randomly divided into the following groups: normal, model, vitamin E (VE), high (10 mg/100 mL), middle (5 mg/100 mL), and low (0.5 mg/100 mL) dose of AU . Except the normal group, each group was irradiated with UVA and UVB light to simulate skin photoaging, and was administered medicine externally daily for 8 weeks. After 8 weeks, these animals were sacrificed, and the back skin tissue was removed. Dermal structure was observed using skin staining with hematoxylin and eosin (HE), and examined by light microscopy (100 magnification). Superoxide dismutase (SOD) activity, total antioxidant capacity (T-AOC), and malondialdehyde (MDA) content were detected by colorimetric assay. Finally, the hydroxyproline (HYP) content and the content of collagen I was detected by amino acid analyzer and enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA), respectively.〔Results〕Compared with model group, the epidermal structure of high doses of AU groups were complete, and the cell layer was relatively clear. The contents of collagen fiber was abundantly and arranged appropriately in dermis; Compared with model group, the activities of SOD、T-AOC and MDA in AU groups was not significantly different, the content of HYP、Collagen I and total amino acids of the high dose AU groups significantly increased, even nearly recovered to the normal level.〔Conclusion〕AU can ameliorate skin photoaging by promoting the synthesis of collagen.

aucubin; anti-skin photoaging; collagen I

1672-7606(2016)04-0244-05

2016-10-11

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(15A360013)

胡倩影(1989-)，女，河南許昌人，研究生，從事中藥延緩衰老作用研究工作。

丁艷霞(1974-)，女，河南開封人，從事中藥延緩衰老作用研究工作。

R285.5

A