王明秋 肖興軍 朱冬梅

黑龍江省科學(xué)技術(shù)廳資助肢帶型肌營養(yǎng)不良相關(guān)基因的克隆和功能研究(D2007-24)

單位名稱：150081 黑龍江省哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[王明秋 肖興軍(通信作者)]；中航工業(yè)哈爾濱242醫(yī)院(朱冬梅)

常染色體隱性遺傳性肢帶型肌營養(yǎng)不良癥研究進展

王明秋 肖興軍 朱冬梅

肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(Limb girdle muscular dystrophy,LGMD)是目前第四大最常見的遺傳性肌肉疾病，其發(fā)病率約為1/20 000[1],據(jù)統(tǒng)計LGMD2型的基因攜帶率為1/72[2]。其作為一大組肌肉疾病，根據(jù)遺傳方式的不同可分為常染色體顯性遺傳性肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(LGMD 1型)和常染色體隱性遺傳性肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(LGMD 2型),其中LGMD2型更為常見，占LGMD的90%，目前可分為25個亞型(2A～2Y)[3-5]。由于其臨床表現(xiàn)和遺傳模式具有高度異質(zhì)性，二者之間的關(guān)系仍是世界范圍內(nèi)的一大難題。本研究就近幾年其各種亞型及分子生物學(xué)等方面的研究進展做一綜述。

1 LGMD2型分子生物學(xué)

目前，已有數(shù)百個LGMDs相關(guān)的基因變異作為致病基因而被報道，然而并非所有的基因變異都真正具有致病性，目前所報道的部分致病基因研究證據(jù)尚不充分，大多數(shù)情況下其致病性的確定通過他們未在健康對照組和/或在小家庭的隔離研究中出現(xiàn)來確定。為進一步明確LGMDs基因變異的致病性以及低頻變異率，Giuseppina 等人通過在Leiden Open Variation Database (LOVD)和Human Gene Mutation Database (HGMD)這2個數(shù)據(jù)庫中搜索所有LGMD2A-2P相關(guān)致病基因的變異，并在NHLBI GO Exome Sequencing Project(ESP)中搜索他們的變異頻率，共獲得85個LGMD2型相關(guān)的基因變異，其中有害變異59個，良性變異18個，致病性未明變異8個，并應(yīng)用生物信息技術(shù)以及統(tǒng)計學(xué)方法，最終得出ESP中包括約9%的既往所報道LGMD2型的變異。此外，基于普通人群的LGMDs患病率(1∶20 000)，進一步得出LGMD2型的等位基因頻率為0.0063，即所公認(rèn)的疾病等位基因頻率比所估計的疾病患病率要高，并指出確定基因變異的致病性，需進一步行復(fù)合雜合性分析以及功能驗證。最終，研究者提出了一些疾病相關(guān)的變異是非致病性的，并且另有一部分基因變異雖然影響了蛋白的功能但仍不具有外顯性，從而驗證了LGMD2型這種異質(zhì)性疾病有著更復(fù)雜的遺傳機制。因此，實際中對于LGMD患者基因變異的錯誤分類將會給其家人的診斷帶來極大的誤導(dǎo)，確定LGMD各個基因變異的致病性至關(guān)重要[2]。

LGMD2型相關(guān)蛋白的致病作用機制各異。目前人們的研究重點已從識別結(jié)構(gòu)蛋白以及其在肌營養(yǎng)不良進展中的意義轉(zhuǎn)向研究蛋白在肌纖維重復(fù)損傷后的維護(dysferlin,、caveolin 3 和anoctamin 5)和應(yīng)激條件下的纖維重塑(calpain 3)中的作用以及此過程中所涉及的蛋白與酶在翻譯修飾中的意義(POMT1,POMT2,POMTGnT1)。盡管先進的分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展與應(yīng)用，目前仍有部分蛋白的功能尚未確定[6]。LGMD2型中SGCG、SGCA、SGCB、SGCD(LGMD2C-2F統(tǒng)稱為肌聚糖病)共同編碼了肌聚糖復(fù)合物，編碼的產(chǎn)物γ、α、β、δ-sarcoglycan共同組成1個跨肌膜的異四聚體，為連接細(xì)胞骨架和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白，發(fā)揮穩(wěn)定肌膜的作用；TRIM32 (LGMD2H)，Myotilin (LGMD1A)以及 DNAJB6 (LGMD1D) 三者均定位于肌節(jié)的Z盤，而Myotilin和DNAJB6均與蛋白聚集有關(guān)，TRIM32的功能至今尚未明確[7-8]。Desmin (LGMD2R和LGMD1E)是肌肉特異性參與蛋白聚集的中間絲蛋白家族成員之一；Plectin(LGMD2Q)是一種可與抗肌萎縮蛋白和β-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖相互作用的膜蛋白；Titin(LGMD2J)是一種巨型肌節(jié)蛋白(從Z線到M線跨越半個肌節(jié)，調(diào)節(jié)肌凝蛋白組裝，作為粗肌絲末端到Z線之間的彈性連接蛋白)；POMT1 (LGMD2K)、 POMT2 (LGMD2N)、POMGnT1 (LGMD2O)和 FKTN (LGMD2M)分別編碼了定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(POMT1 和 POMT2)以及高爾基體(POMGnT1 and FKTN)上的糖基轉(zhuǎn)移酶，并參與細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白的糖基化，這些糖基化轉(zhuǎn)移酶對細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞骨架的連接至關(guān)重要[7]。

LGMD2A作為世界范圍內(nèi)LGMD中最常見的亞型，其臨床表現(xiàn)、致病基因、肌肉病理特點等方面已研究較透徹，該型由編碼肌肉特異性鈣激活中性蛋白酶-3(calpain-3，CAPN3)的基因突變引起，突變位點在染色體15q15.1～q21.1上。calpain-3并非骨架蛋白，這種酶存在胞漿及胞核中,它通過肌肉特異性的序列IS2與肌聯(lián)蛋白(titin)相連，其功能可能與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)有關(guān)[9]。目前為止，已有>500個突變位點被報道。Calpain是一種Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白酶，其分布于人體全身各處；鈣激活蛋白酶家族中任何一個成員的功能缺失都將會導(dǎo)致不同的病變，例如胚胎致死、胃病、肌營養(yǎng)不良或血小板功能障礙。在人體基因組織中共發(fā)現(xiàn)15個鈣激活蛋白酶家族成員(CAPN1-CAPN15)，其中CAPN3僅表達于骨骼肌中，且僅需要較低的鈣離子濃度(生理狀態(tài)下)便可激活。NCX3為鈉鈣交換體家族成員之一，也表達于骨骼肌的三聯(lián)管中，且多項研究已證明其參與了肌質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的回收。2016年Lauriane等人提出caipain-3為作用于肌肉的新靶點，CAPN3基因?qū)∪庥休^強的敏感性，而該敏感性被認(rèn)為僅由骨骼肌中NCX3-AC這一突變型產(chǎn)生；該種基因的直接裂解突變可導(dǎo)致CAPN1和 CAPN3的轉(zhuǎn)換，進而干擾繼發(fā)于興奮收縮解耦聯(lián)的肌質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放以及與其他離子的轉(zhuǎn)運，從而導(dǎo)致LGMD2A型疾病的發(fā)生。由此，CAPN3所介導(dǎo)的鈉鈣交換體NCX3的功能失調(diào)會導(dǎo)致諸如LGMD2A型等多種肌肉病變[10]。

2014年Ana Cotta等人研究報道發(fā)現(xiàn)，同一家族中的3例患者同為calpain-3基因突變，其中2例突變位點相同，但3例患者的肌肉病理均呈現(xiàn)為不同類型、不同程度的肌營養(yǎng)不良性改變。由此可見，LGMD基因型與表型之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，還有待于進一步研究[9]。

LGMD2C是最嚴(yán)重的亞型之一，多于兒童起病，其進展常比較迅速，多數(shù)患者在起病10年后喪失行走能力,并于29歲前死亡。2014年Samiah等人對4個西班牙無血緣關(guān)系家系中的4例LGMD2C患者的SGCG突變基因進行微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多態(tài)性分析，其中2例患者表現(xiàn)為兒童起病，但病程進展緩慢，于40歲左右喪失活動能力。在這4例患者中使用6種多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記物分別在SGCG基因的內(nèi)部(D13S232)和兩側(cè)(D13S175,D13S292,D13S787,D13S1243,D13S283)進行標(biāo)記，其中D13S232和D13S292兩種標(biāo)記物高度提示了4個家系的LGMD2C患者均為單倍體型的SGCG等位基因突變。有研究顯示，SGCG基因的c.787G>A (p.E263K)位點的錯義突變?yōu)槲靼嘌繪GMD2C患者中的一種原始基因突變，并且該種突變的患者可相對較長時間保留活動能力，且進展緩慢，并進一步證明了LGMD患者突變基因型的多態(tài)性[11]。

2015年Claudio Semplicini等人對25個LGMD2E型家系中的32例患者(16例男性和16例女性)進行臨床表型、基因型、蛋白表達的回顧性分析，并從患者外周血或肌肉組織中提取基因組DNA進行單鏈構(gòu)象多態(tài)性測序分析或直接測序分析，最終得出LGMD2E型患者SGCB基因突變譜，共發(fā)現(xiàn)了17個突變位點，其中有5個為新發(fā)現(xiàn)的突變位點即c.518_519insC、c.543C>G、c.754_957del、c.36_37delinsG、c.1A>G，并進一步擴展了LGMD2E的表型范圍，由輕到重各不相同，因此僅依靠臨床表現(xiàn)進行肌聚糖病(LGMD2C、2D、2E、2F)4個亞型之間的鑒別診斷是不可行的，只有通過對編碼4種肌聚糖蛋白的基因進行分子生物學(xué)分析，才能準(zhǔn)確地做出鑒別診斷。此外，還可通過SGCB基因突變類型以及肌聚糖蛋白的表達來預(yù)測患者臨床癥狀的嚴(yán)重程度。報道統(tǒng)計，LGMD2E型患者中約50%以上伴有心肌受累，并且其可獨立于肌無力在病程中的任何階段出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)在骨骼肌受累之前[12]。

LGMD2X最先發(fā)現(xiàn)于1個阿爾巴尼亞的家系中，共4例患者，該亞型是由6q21染色體上的編碼POPDC1蛋白的基因突變所致，其突變位點為c.602C>T、p.S201F，POPDC1編碼的BVES蛋白存在于細(xì)胞膜、肌纖維的T-小管以及核膜上，是一種環(huán)磷酸腺苷結(jié)合蛋白，可在骨骼肌和心肌細(xì)胞中表達，并參與上皮細(xì)胞間緊密連接的通透性屏障的形成與調(diào)控以及囊泡運輸，并與小窩蛋白3(Caveolin-3)和TREK-1鉀離子通道蛋白相互作用。臨床上主要于30～50歲起病，表現(xiàn)為對稱性近端肢體無力，可伴有心肌受累，主要表現(xiàn)為心源性暈厥以及房室傳導(dǎo)阻滯；實驗室檢查主要為血清CK增高(700～8 000 U/L)肌肉病理可見肌纖維大小不一，核內(nèi)移，肌纖維壞死與再生[4]。

LGMD2Y報道于1個土耳其家系中，共3例患者。該亞型是由1q25.2染色體上編碼TOR1ATP1蛋白的LAP1B基因突變所致，即c.186delG位點的純合子移碼突變。LAP1B蛋白定位于核內(nèi)膜，是一種A型和B型核纖層蛋白結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)ATP酶的活性。臨床起病年齡為10歲左右，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)攣縮，主要表現(xiàn)為脊柱強直以及遠端或近端的指間關(guān)節(jié)的攣縮，且主要為肢帶肌的無力，目前只有1例患者被報道伴有心肌受累(擴張型心肌病)。實驗室檢查為血清CK可增高(80～500 U/L)，肌肉病理可見肌纖維大小不一，核內(nèi)移，輕度的壞死，肌內(nèi)膜結(jié)締組織增多，蛋白印記可見TOR1AIP1蛋白的缺失，肌纖維的亞顯微結(jié)構(gòu)可見核膜異常改變[5]。

2 LGMD的基因治療

關(guān)于LGMD治療方面的進展大多數(shù)來自于動物模型試驗中，常通過對可誘發(fā)疾病藥物的逆轉(zhuǎn)或者通過破壞缺陷基因下游中的某些步驟來獲得。越來越多的證據(jù)表明CAPN3基因轉(zhuǎn)移和應(yīng)用基因突變的肌肉生長抑制素前肽是calpainopathy小鼠模型治療的有效手段，然而肌肉中基因的持久性相對較差(9 d)，利用肌內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移還不足以改善生活質(zhì)量，并且用于評估改善程度的參數(shù)較難獲得，例如收縮力，這需要在體外測得。因此，該治療方法是否有效還有待于進一步研究。

據(jù)報道，一些新的治療策略已試行于治療DYSF基因缺陷性肌病中。最具特點的研究是Han等人提出補體成分C3的裂解可作為LGMD2B型的治療靶點，但由于動物模型中肌肉收縮力測定的限制，其具體療效還無法做以詳細(xì)的評估。此外，其還提出膜攻擊復(fù)合物(MAC)并不能作為治療的靶點，因為在該研究中同時發(fā)現(xiàn)C5消融(1個MAC的通路終端組件)對疾病的影響很小。這個問題應(yīng)該還需在未來的試驗中利用炎癥和非炎癥模型進一步驗證。此外，Lerario等人還提出利用淋巴細(xì)胞的滅減治療方法來治療dysferlin肌病(Dysferlin突變的3種類型如LGMD2B、Miyoshi肌病以及早期累及脛前肌群的肌病統(tǒng)稱為dysferlin肌病)[13-14]。

在sarcoglycanopthies(肌聚糖蛋白病)患者中基因轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞移植、肌肉生長抑制素的阻斷以及鈣通道阻滯劑已在體內(nèi)、外研究中應(yīng)用。值得慶幸的是，肌聚糖蛋白病由于其基因較小，因此比其他類型的LGMD更容易取得基因治療的成果。

盡管在動物模型試驗中已經(jīng)證明許多的治療方法是安全有效的，但鑒于2個物種之間大小、壽命、遺傳變異和免疫復(fù)雜性之間的明顯差異，仍需謹(jǐn)慎這些治療方法對于人類的適用性。

3 LGMD2型各個亞型之間鑒別診斷的重要性

LGMD診斷過程中除了注意與其他類型肌肉疾病鑒別外，近年來所提出的另一個重要并且具有挑戰(zhàn)性的方面是LGMD各個亞型之間的鑒別，這對于遺傳咨詢、心肺疾病危險因素的評估、判斷預(yù)后以及未來的靶向治療的研究進展至關(guān)重要。其主要通過臨床檢查和肌肉MRI篩查出首先受累的具體肌群。此外，還需進一步評估肌營養(yǎng)不良的類型、肌肉組織活檢形態(tài)學(xué)檢查、免疫組化和蛋白印記以及基因檢測[14]。

肌聚糖病(LGMD2C,LGMD2D,LGMD2E 和LGMD2F)、Telethonin蛋白病(LGMD2G)以及fukutin相關(guān)蛋白病(LGMD2I) 都具有較高的心肌病變的風(fēng)險，其中LGMD2I患者可能在具有活動能力的疾病早期時便出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)的受累[9]，而calpainopathy (LGMD2A)和dysferlinopathy (LGMD2B)型患者心肌受累的風(fēng)險可與普通人群相似。LGMD2I和LGMD2K型患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累以及精神發(fā)育遲滯均較少出現(xiàn)[14]。LGMD2B和LGMD2G型患者的病程進展通常較緩慢；LGMD2A和LGMD2I型患者病程進展速度適中，而肌聚糖病(LGMD2C-2F)進展迅速[7]。

LGMD各個亞型肌肉的受累特點各不相同。據(jù)報道，LGMD2A和2I型患者的肌肉MRI顯示為大腿后群肌肉的受累；LGMD2B和2G型患者主要為整個大腿肌群的受累；LGMD2C-2F型患者常為股四頭肌受累，而無腓腸肌的受累[15]。LGMD2L型患者的肌肉MRI可表現(xiàn)為骨薄肌、縫匠肌、股二頭肌短頭以及脛骨前肌均受累[16]。由此可見，MRI檢查有望在少部分LGMD患者中替代創(chuàng)傷性肌肉活檢而直接進行相關(guān)基因檢測[6]。

4 結(jié)束語

LGMD所包含的疾病譜系較廣，隨著新家系和缺陷基因的發(fā)現(xiàn)會對其不斷修正和補充。近幾年分子生物學(xué)領(lǐng)域的迅速發(fā)展為完善LGMD的診斷、分類、發(fā)病機制和治療開辟了新的途徑。然而，我們對LGMD各個亞型致病機制的認(rèn)識還處于起步階段，因此對于LGMD2型的研究還需進一步細(xì)化深入，這對于疾病的治療、轉(zhuǎn)歸以及預(yù)后有著重要的意義[6]。

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R746.2

A

1007-0478(2017)05-0481-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.029

(2016-10-23收稿)