■劉 洋 張亞峰 張 宇

(廣州施華科技有限公司，廣東廣州 510800)

隨著抗生素在全球范圍內(nèi)的限用，雞壞死性腸炎的發(fā)病率明顯升高，造成養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟損失，同時，通過雞肉制品引起人感染，也給人類食品安全提出嚴峻的考驗。因此開發(fā)利用天然物質(zhì)替代抗生素就成為近年的熱點之一。

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens),又稱韋氏梭菌(Clostridium welchii),是一種梭狀芽孢菌屬條件性致病菌,在自然界分布非常廣,可引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥,同時也是人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽及人類食物中毒的主要病原菌之一。該菌分為A、B、C、D、E 5個型，通常A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起家禽的壞死性腸炎。

壞死性腸炎是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種條件性疾病，臨床表現(xiàn)為嚴重的小腸黏膜壞死，從而導致家禽急性死亡和高死亡率，對全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌正常情況下棲息于畜禽盲腸，不會引起發(fā)病，但當腸黏膜受到損傷或腸道菌群發(fā)生變化時，它就會在消化道前段大量增殖，從而導致壞死性腸炎的發(fā)生。

單寧酸是一種水溶性多酚混合物，分子量在500～3 000之間。盡管幾乎所有植物都含有少量的單寧酸,但根據(jù)不同分子量、植物源種類、植物年份、生長地理位置、提取工藝、不同來源，并不是所有單寧酸都可以被動物消化及利用。單寧酸的應用也是多方面的，涵蓋了皮革、食品、釀酒和精細化工等，在歐洲通過長期深入的研究發(fā)現(xiàn)單寧酸在動物營養(yǎng)領(lǐng)域的良好效果，使其在飼料添加劑方面得到廣泛的應用。意大利施華公司生產(chǎn)的栗木水解單寧提取的單寧酸有很強的收斂、抗氧化效果，高效抑菌和殺滅病毒作用，有效的抑制許多植物源和動物源病原體，從而提高了動物體的健康水平及食品的安全程度，也得到的良好的投入回報率。

本文旨在探討栗木水解單寧對于產(chǎn)氣莢膜梭菌體外抑制作用的試驗驗證，并進一步證明栗木水解單寧對動物生長過程中由產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的壞死性腸炎腸道疾病問題的改善作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 栗木水解單寧

試驗用栗木水解單寧產(chǎn)自意大利施華公司，提取來源為意大利北部公司自有的栗木森林，主要成分單寧酸含量75%以上。

1.1.2 指示菌

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌株A是在隨機抽取健康動物的糞便中提取。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株D來自于隨機抽取患有腸道疾病動物的糞便中提取。

1.1.3 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基、庖肉培養(yǎng)基、厭氧蛋白胨水、增菌厭氧湯。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

糞便樣品采集：在試驗地區(qū)每個雞場分別隨機采集健康和患有腸道疾病雞的新鮮糞便各20份。共采集新鮮糞便200份。新鮮樣品采集后放入樣品采集袋中，再將采集袋放入冰盒中帶回實驗室待檢。

動物腸道采集：對15日齡的家禽試驗動物飼喂添加0.05%栗木單寧，分別在19日和30日進行安樂死后，并對其解剖檢測腸道（小腸、空腸和回腸）的損傷狀況。取各部腸道4 cm，縱向剖開，用冰凍生理鹽水清洗多次，觀察后切成1 cm長小段，用錫箔紙包裹迅速放入液氮中，速凍后取出放-70℃凍存。

1.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)

試驗前一晚將產(chǎn)氣莢膜梭菌置于皰肉培養(yǎng)基(CMM)培養(yǎng)，使菌株培養(yǎng)在皰肉培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)后置于滅菌離心管內(nèi)于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌進行倍比稀釋

每次取1 ml菌液進行稀釋，使用10 ml高壓滅菌后的離心管，用滅菌生理鹽水進行稀釋，每次稀釋10倍。

1.2.4 體外抑菌分析

將分離保存的產(chǎn)氣莢膜梭菌稀釋液（0.1 ml）在皰肉培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h進行復蘇備用。取復蘇后的稀釋液在添有栗木單寧（0.1 mg/ml）的瓊脂板上培養(yǎng)18 h后菌落開始生長并開始計數(shù)。

1.2.5 栗木單寧的殺菌分析

栗木單寧對于菌株生長的作用取決于不同的濃度。產(chǎn)氣莢膜梭菌經(jīng)過一晚的培養(yǎng)后，接種0.2 ml到瓊脂板培養(yǎng)基。對比分析產(chǎn)氣莢膜梭菌A（提取于健康動物）和D（提取于患有腸道疾病動物），在含有栗木單寧溶液的培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)。用無栗木單寧溶液的皰肉培養(yǎng)基作為空白對照，每組兩個重復。然后定時對比試驗組與對照組的細菌濃度。

1.2.6 栗木單寧最小抑菌濃度（MIC）測定

將栗木單寧進行一系列的稀釋處理，在厭氧條件下將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種到混有不同濃度的栗木單寧的皰肉培養(yǎng)基試管中，在37℃中培養(yǎng)12 h，通過對試管進行肉眼觀察，是否變渾濁有細菌生長。通過是否在不同濃度培養(yǎng)基上有細菌生長來判斷栗木單寧是否對產(chǎn)氣莢膜梭菌有抑制作用，從而根據(jù)哪個濃度培養(yǎng)基有細菌生長來判斷最小抑菌濃度（MIC）。10個試管中的栗木單寧濃度分別為0、0.000 5、0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.05、0.1、0.15 mg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 栗木單寧抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低濃度(見表1)

表1 栗木單寧最低的抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的濃度

通過對比分析，由表1可知栗木單寧可抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌A和D的作用。當栗木單寧的濃度在0.003～0.15 mg/ml時對產(chǎn)氣莢膜梭菌A和D產(chǎn)生抑制作用。當栗木單寧的濃度在0.01 mg/ml開始對產(chǎn)氣莢膜梭菌A起抑制作用，當栗木單寧的濃度在0.003 mg/kg開始對產(chǎn)氣莢膜梭菌D起抑制作用，產(chǎn)氣莢膜梭菌D對于栗木單寧的敏感程度強于產(chǎn)氣莢膜梭菌A。

2.2 栗木單寧對于產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用(見圖1)

圖1 不同濃度的栗木單寧對于產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素活性的影響

栗木單寧對于分離自健康動物的產(chǎn)氣莢膜梭菌A和分離自患有腸道疾病的動物的產(chǎn)氣莢膜梭菌D毒素活性的影響做了對比。隨著栗木單寧濃度增加，兩種菌株的毒素活性明顯降低了。栗木單寧濃度為0.2 mg/ml可有效減少產(chǎn)氣莢膜梭菌A50%的毒素活性，濃度為0.3 mg/ml時可減少產(chǎn)氣莢膜梭菌D50%毒素活性。因此，栗木單寧到達一定濃度時，對產(chǎn)氣莢膜梭菌起到有效的抑制作用。

2.3 栗木單寧的殺菌活性(見圖2)

圖2 栗木單寧（Nutri.P）對于產(chǎn)氣莢膜梭菌A和D的殺菌活性影響作用

栗木單寧在抑制提取自健康動物的產(chǎn)氣莢膜梭菌A和提取自患有腸道疾病的動物的產(chǎn)氣莢膜梭菌D活性方面都表現(xiàn)出了明顯的作用。由圖2可知，使用栗木單寧殺菌0.5 h后就在產(chǎn)氣莢膜梭菌D上面有明顯體現(xiàn)，在使用2～4 h后殺菌效果體現(xiàn)在產(chǎn)氣莢膜梭菌A上面。在5 h之后，就可以看到在兩種菌株上，栗木單寧完全體現(xiàn)了殺菌活性的效果。

2.4 栗木單寧對于壞死性腸炎攻毒狀況下的腸道損傷的影響（見圖3）

試驗發(fā)現(xiàn)，對照組小腸、空腸和回腸的損傷評分明顯高于試驗組。對照組小腸、空腸和回腸的損傷頻率也明顯高于試驗組。所以添加栗木單寧對于因為產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的壞死性腸炎對于腸道損傷的改善效果非常顯著。

圖3 栗木單寧對于壞死性腸炎攻毒狀況下的腸道損傷的影響

2.5 栗木單寧對于壞死性腸炎攻毒狀況下肉禽增重的影響(見圖4)

圖4 栗木單寧對于壞死性腸炎攻毒狀況下肉禽增重的影響

試驗發(fā)現(xiàn)在試驗5 d內(nèi)時，試驗組的增重會略低于對照組，但在9 d后慢慢上升直到14 d時試驗組的增重明顯高于對照組。說明添加栗木單寧對于通過改善因為產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的壞死性腸炎對于腸道損傷的影響可以明顯提升動物的生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟效益。

3 結(jié)論

本試驗說明栗木單寧對產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長速率有明顯的抑制作用，降低了由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的壞死性腸炎對腸道的影響，對提高家禽的增重隨時間的增加有顯著效果。試驗所用栗木水解單寧是一種水溶性天然植物提取物，成分包括水解單寧酸、糖、纖維素、半纖維素及一些有機鹽等，具有收斂性，可調(diào)控腸道蠕動，提升消化酶的活性和日糧在腸道中的消化利用率，能有效地改善腸道健康，抑制病毒以及有害菌的繁殖，促進動物生長，是很好的抗生素替代產(chǎn)品。