■Mazu Sabirath Shanti 林俊宏 朱劍鋒 朱 輝 李楚君 龐 旭 董 璐 胡文鋒，，*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州510642；2.汕頭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東汕頭515078；3.生物源生物技術(shù)(深圳)股份有限公司，廣東深圳518118；4.廣州無兩生物科技有限公司，廣東廣州510642）

全球人口持續(xù)增長，2050年將達(dá)到90億，因而未來人類對蛋白類食物如肉、蛋、奶的需求量將越來越大。禽畜養(yǎng)殖業(yè)及屠宰加工行業(yè)每年都會產(chǎn)生大量的羽毛，而羽毛中含大量的角蛋白，因此是一個巨大的蛋白質(zhì)和必需氨基酸來源[1]。角蛋白可通過物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法進(jìn)行降解而資源化利用。但物理和化學(xué)降解可能破壞某些氨基酸，并產(chǎn)生其他非營養(yǎng)氨基酸[2]，因此利用微生物和酶等生物學(xué)方法降解角蛋白是未來廢棄羽毛利用的一大趨勢。

黑水虻（學(xué)名：亮斑扁角水虻，Hermetia illucens L.），其幼蟲是一種食用昆蟲，可以為動物及人類提供優(yōu)質(zhì)的蛋白。黑水虻具有繁殖速度快、生長周期短、管理方便、營養(yǎng)豐富、動物適口性好等特點(diǎn)，在替代動物飼料蛋白原料方面具有廣闊前景，正在世界范圍內(nèi)推廣[3-4]。相關(guān)研究表明，角蛋白的空間結(jié)構(gòu)十分牢固，因此黑水虻幼蟲不能直接消化利用羽毛。為此，本試驗(yàn)以雞羽毛為底物，以從蛇胃腸道篩選得到蠟樣芽孢桿菌YSQ08為發(fā)酵菌種，配合角蛋白酶，對羽毛進(jìn)行降解處理，優(yōu)化生產(chǎn)工藝條件，提高角蛋白的降解效率。之后將羽毛發(fā)酵產(chǎn)物制成黑水虻幼蟲飼料，研究羽毛發(fā)酵物對黑水虻幼蟲生長性能的影響。試驗(yàn)旨在為廢棄羽毛的高效資源化處理和利用開發(fā)新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

雞毛由廣東某生雞屠宰公司提供，經(jīng)洗滌劑漂洗、自來水清洗后烘干粉碎，備用；蠟樣芽孢桿菌YSQ08（Bacillus cereusYSQ08）分離自蛇消化道內(nèi)容物，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室提供；角蛋白酶購自濟(jì)南諾能生物工程有限公司，酶活20 000 U/g；新鮮干凈豬糞由廣州良種豬場提供。黑水虻幼蟲由廣州無兩生物科技有限公司提供，按常規(guī)程序進(jìn)行養(yǎng)殖。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

菌種分離培養(yǎng)基（液體）：0.50 g氯化鈉（NaCl）、0.06 g無水氯化鈣（CaCl2）、0.10 g氯化鎂（MgCl2）、1.40 g磷酸氫二鉀（K2HPO4）、0.70 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）。用0.1 M NaOH溶液將pH值調(diào)至7.0，蒸餾水定容至1 000 ml，按每瓶100 ml加2.0 g羽毛分裝于250 ml錐形瓶中，121℃滅菌30 min，備用。若加入2.0%瓊脂粉，則為分離菌種用的固體培養(yǎng)基。

蠟樣芽孢桿菌YSQ08種子培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨（Tryptone）、5 g酵母提取物（Yeast Extract）、10 g氯化鈉（NaCl），蒸餾水定容至1 000 ml；用0.1 M NaOH溶液將pH值調(diào)至7.0；按每瓶100 ml分裝于250 ml錐形瓶中，121℃滅菌30 min，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蠟樣芽孢桿菌YSQ08的活化與純化

菌種活化：從-80℃冰箱取出蠟樣芽孢桿菌YSQ08，在LB平板上畫線，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，重復(fù)一次，即得到初步活化的蠟樣芽孢桿菌YSQ08單菌落培養(yǎng)液。革蘭氏染色，觀察顏色以及細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)為紫色的革蘭氏陽性菌。如有雜菌，重復(fù)上述步驟多次，達(dá)到活化與純化的目的。

再次挑取單菌落接種于帶羽毛的液體分離培養(yǎng)基試管中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。試管發(fā)酵完畢后，取2.0 ml發(fā)酵液轉(zhuǎn)接于100 ml帶羽毛液體分離培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。接種環(huán)沾取上述發(fā)酵液在LB平板上畫線，37℃培養(yǎng)14 h；再挑取單菌落轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，得到能大量分泌角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌YSQ08純種。

1.2.2 生長曲線的測定

將經(jīng)活化與純化得到的蠟樣芽孢桿菌YSQ08進(jìn)行批次液體培養(yǎng)，測定生長曲線。蠟樣芽孢桿菌YSQ08按1%接種量接入液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 ml/250 ml，于37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。采用比濁法，每2 h測定蠟樣芽孢桿菌YSQ08培養(yǎng)液十倍稀釋液的OD600值，繪制生長曲線。

1.2.3 不同pH值對羽毛降解的影響

按1%(v/v)接種量制備蠟樣芽孢桿菌YSQ08種子，按每克羽毛添加2 000 U角蛋白酶（發(fā)酵1 d后添加）、羽毛添加量2.0%(w/v)、接種量2.0%(v/v)，37 ℃、200 r/min發(fā)酵3 d。用0.1 M NaOH溶液將發(fā)酵液初始pH值分別調(diào)到7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。發(fā)酵結(jié)束測定羽毛降解率。

1.2.4 不同角蛋白酶添加量對羽毛降解的影響

按1%(v/v)接種量制備蠟樣芽孢桿菌YSQ08種子液，在pH值9.0、羽毛添加量2.0%(w/v)、接種量2.0%(v/v)的條件下，37℃、200 r/min發(fā)酵3 d；設(shè)置發(fā)酵1 d后每克羽毛添加角蛋白酶量分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U。發(fā)酵結(jié)束測定羽毛降解率。

1.2.5 不同細(xì)菌接種量對羽毛降解的影響

按1%(v/v)接種量制備蠟樣芽孢桿菌YSQ08種子液，在pH值9.0、每克羽毛添加2 000 U角蛋白酶（發(fā)酵1 d后添加）、羽毛添加量2.0%(w/v)的條件下，37℃、200 r/min發(fā)酵3 d，接種量(v/v)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。發(fā)酵結(jié)束測定羽毛降解率。

1.2.6 不同羽毛添加量對羽毛降解的影響

按1%(v/v)接種量制備蠟樣芽孢桿菌YSQ08種子液，在pH值9.0、每克羽毛添加2 000 U角蛋白酶（發(fā)酵1 d后添加）、接種量3.0%(v/v)的條件下，37℃、200 r/min發(fā)酵3 d，羽毛添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%(w/v)。發(fā)酵結(jié)束測定羽毛降解率。

1.2.7 在不同發(fā)酵時間的羽毛降解率

按1%(v/v)接種量制備蠟樣芽孢桿菌YSQ08種子液，在pH值9.0、每克羽毛添加2 000 U角蛋白酶（發(fā)酵1 d后添加）、羽毛添加量2.5%(w/v)、接種量3.0%(v/v)的條件下，37℃、200 r/min進(jìn)行發(fā)酵，分別在發(fā)酵1、2、3、4、5、6、7 d檢測羽毛降解率。

1.2.8 羽毛降解產(chǎn)物及豬糞的常規(guī)檢測

使用優(yōu)化得到的工藝條件進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后分別收集處理，得到發(fā)酵液干物質(zhì)、上清液干物質(zhì)和沉淀干物質(zhì)，將收集得到的豬糞放入烘箱烘干，檢測各降解產(chǎn)物和豬糞的粗蛋白質(zhì)含量、水分含量和粗灰分含量。

1.2.9 黑水虻養(yǎng)殖效果評價

設(shè)立3個試驗(yàn)組，分別為發(fā)酵液干物質(zhì)、上清液干物質(zhì)、沉淀干物質(zhì)和1個豬糞對照組，每個組設(shè)3個平行試驗(yàn)，每個平行試驗(yàn)取4日齡的黑水虻幼蟲50頭，放入長12 cm、寬8 cm、高10 cm的幼蟲培養(yǎng)盒。將3種羽毛發(fā)酵降解后的干物質(zhì)和豬糞分別作為試驗(yàn)飼料，分批加入到對應(yīng)的幼蟲培養(yǎng)盒中，記錄每次的投料量，當(dāng)出現(xiàn)一半預(yù)蛹時停止加料，計算幼蟲的平均增重、料重比和存活率。

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1 羽毛降解率

將降解產(chǎn)物倒入鋪有快速濾紙的布氏漏斗中進(jìn)行抽濾，并用蒸餾水將錐形瓶內(nèi)殘渣洗到濾紙上，重復(fù)2～3次。將濾紙和濾渣放入105℃烘箱烘干至恒重后，放入干燥器內(nèi)，待恢復(fù)至室溫稱量重量。

式中：m0——濾紙質(zhì)量(g)；

m1——處理前雞毛質(zhì)量(g)；

m2——濾紙和殘渣總重(g)。

1.3.2 黑水虻平均增重

記錄每個平行試驗(yàn)開始時，50頭4日齡黑水虻幼蟲總重m0，試驗(yàn)結(jié)束時將幼蟲用8目篩篩出，記錄存活黑水虻幼蟲總重m1和數(shù)量n。

1.3.3 黑水虻料重比

記錄每個平行試驗(yàn)開始時，50頭4日齡黑水虻幼蟲總重m0，試驗(yàn)結(jié)束時將幼蟲用8目篩篩出，記錄黑水虻幼蟲（含死蟲）總重m2和總耗料量m3。

1.3.4 黑水虻存活率

試驗(yàn)結(jié)束時將幼蟲用8目篩篩出，記錄幼蟲的存活數(shù)n。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種生長曲線（見圖1）

生長曲線反映了菌株生長繁殖的特性，通過研究菌株的生長曲線能有效區(qū)分不同培養(yǎng)時間菌株所處的生長階段。經(jīng)過培養(yǎng)處于對數(shù)生長期后期的種子液，活菌數(shù)較大，且菌體活性較高，有利于縮短發(fā)酵時的延滯期從而提高生產(chǎn)效率[5]。由圖1可見，培養(yǎng)4 h后蠟樣芽孢桿菌YSQ08進(jìn)入對數(shù)生長期，18 h到達(dá)對數(shù)生長期末期，培養(yǎng)20 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期，培養(yǎng)36 h后進(jìn)入衰亡期。綜合考慮，確定蠟樣芽孢桿菌YSQ08種子液的培養(yǎng)時間為16 h。

圖1 蠟樣芽孢桿菌YSQ08生長曲線

2.2 不同pH值對羽毛降解的影響（見圖2）

圖2 不同發(fā)酵液pH值羽毛降解率的變化

由圖2可見，在發(fā)酵液pH值為7.0～9.0時，隨著pH值的升高，羽毛降解率快速上升；在發(fā)酵液pH值為9.0時，羽毛降解率達(dá)到最高為80.92%；在發(fā)酵液pH值為9～12時，隨著pH值的升高，羽毛降解率逐漸下降。這是因?yàn)橹袕?qiáng)堿的環(huán)境不利于蠟樣芽孢桿菌YSQ08生長，導(dǎo)致降解率開始下降。因此，選擇發(fā)酵液pH值9.0，羽毛降解率最高。

2.3 不同角蛋白酶添加量對羽毛降解的影響(見圖3)

由圖3可見，隨著角蛋白酶添加量的提高，羽毛降解率呈先升高后降低的趨勢。在角蛋白酶添加量為500 U時，羽毛降解率為65.81%。當(dāng)提高角蛋白酶添加量時，羽毛降解率逐漸上升，在添加量為2 000 U時，羽毛降解率達(dá)到峰值為77.74%。進(jìn)一步提高角蛋白酶添加量，羽毛降解率緩慢下降，在添加量為4 000 U時，羽毛降解率為66.22%。因此，選擇每克羽毛角蛋白酶添加量為2 000 U，羽毛降解率最高。

圖3 不同角蛋白酶添加量羽毛降解率的變化

2.4 不同細(xì)菌接種量對羽毛降解的影響（見圖4）

圖4 不同細(xì)菌接種量羽毛降解率的變化

由圖4可見，隨著接種量的提高，羽毛降解率呈緩慢上升的趨勢，在接種量為3%時，羽毛降解率達(dá)到最大為75.13%。接種量的大小對菌體生長速度有巨大的影響。當(dāng)接種量過小時，菌體生長速度較慢，發(fā)酵周期延長且易染菌；但接種量過大則菌體生長過快，造成營養(yǎng)物質(zhì)缺乏或溶氧不足，從而影響酶的合成[6]。因此，選擇3%作為羽毛降解菌種接種量。

2.5 不同羽毛添加量對羽毛降解的影響（見圖5）

由圖5可見，隨著羽毛添加量的提高，羽毛降解率先升高后降低。在羽毛添加量為2.5%時，羽毛降解率達(dá)到最大值為74.53%。相關(guān)研究表明，多數(shù)角蛋白酶是誘導(dǎo)型蛋白酶，一般隨著底物添加濃度的升高，酶活有相同的變化趨勢[7-8]。因此，本試驗(yàn)中羽毛添加量為0.5%～2.5%時，羽毛降解率隨著羽毛添加量的提高而升高。當(dāng)進(jìn)一步提高羽毛添加量時，羽毛降解率開始快速下降。這可能是因?yàn)橛鹈砑恿窟^高降低了培養(yǎng)環(huán)境的溶氧量，抑制了蠟樣芽孢桿菌的生長，降低了蠟樣芽孢桿菌降解羽毛的生產(chǎn)效率[9]。因此，選擇羽毛添加量為2.5%，羽毛降解率最高。

圖5 不同羽毛添加量羽毛降解率的變化

2.6 在不同發(fā)酵時間的羽毛降解率（見圖6）

圖6 不同發(fā)酵時間的羽毛降解率的變化

由圖6可見，隨著發(fā)酵時間的延長，羽毛降解率呈先快速升高后趨于穩(wěn)定的趨勢。在發(fā)酵時間為1～5 d時，羽毛降解率上升速度較快，平均增長率為7.24%，在發(fā)酵時間為5 d時，羽毛降解率達(dá)到80.04%；在發(fā)酵時間為5～7 d時，羽毛降解率相對穩(wěn)定，平均增長率僅為0.79%。不同發(fā)酵時間羽毛降解率的變化趨勢體現(xiàn)了發(fā)酵時間對菌種生長和酶活的影響，發(fā)酵5 d后，羽毛降解率相對穩(wěn)定，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)消耗殆盡，再加上其他副產(chǎn)物的影響，菌種活性下降甚至死亡，酶分泌量下降，造成羽毛降解率上升放緩[10]。因此，選擇發(fā)酵時間為5 d，羽毛降解率最高。

2.7 羽毛降解產(chǎn)物及豬糞常規(guī)檢測（見表1）

表1 各降解產(chǎn)物及豬糞常規(guī)檢測結(jié)果(%)

由表1可見，沉淀干物質(zhì)的粗蛋白質(zhì)含量最高，可達(dá)到92.36%，其次為發(fā)酵液干物質(zhì)，達(dá)到87.35%，再次為上清液干物質(zhì)，達(dá)到41.43%，最低為豬糞，達(dá)到16.12%；發(fā)酵液干物質(zhì)、上清液干物質(zhì)、沉淀干物質(zhì)和豬糞的含水量分別為5.41%、6.68%、5.32%、10.17%；發(fā)酵液干物質(zhì)的粗灰分最低，可達(dá)到4.33%，其次為豬糞，達(dá)到6.10%，再次為沉淀干物質(zhì)，達(dá)到7.46%，最高為上清液干物質(zhì)，達(dá)到22.73%。上清液干物質(zhì)的粗灰分較高，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基在配制的過程中添加了一定量的鹽類，而這些鹽類溶解于上清液，從而導(dǎo)致上清液干物質(zhì)粗灰分較高；另一方面，上清液中的含氮物質(zhì)多為小分子的氨基酸和肽，而大分子的多肽和蛋白質(zhì)仍存在于沉淀物中，從而導(dǎo)致上清液干物質(zhì)的粗蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵液干物質(zhì)和沉淀干物質(zhì)低。

2.8 黑水虻平均增重（見圖7）

圖7 不同飼料對黑水虻平均增重的影響

由圖7可見，使用上清液干物質(zhì)作為飼料，黑水虻平均增重最高，為0.239 9 g/頭，其次為豬糞，為0.217 9 g/頭。使用發(fā)酵液干物質(zhì)和沉淀干物質(zhì)作為飼料，黑水虻平均增重均低于豬糞組。結(jié)合表1可知，上清液干物質(zhì)和豬糞的粗蛋白質(zhì)含量均低于發(fā)酵液干物質(zhì)和沉淀干物質(zhì)，但黑水虻平均增重試驗(yàn)結(jié)果均優(yōu)于其他兩組。這可能是因?yàn)?，發(fā)酵液干物質(zhì)和沉淀干物質(zhì)中含大量消化率較低的蛋白質(zhì)，如角蛋白等。使用發(fā)酵液干物質(zhì)和沉淀干物質(zhì)作為飼料，仍有相當(dāng)一部分蛋白質(zhì)不能得到有效利用。

2.9 黑水虻料重比（見圖8）

圖8 不同飼料對黑水虻料重比的影響

由圖8可知，使用上清液干物質(zhì)作為飼料，可使黑水虻料重比達(dá)到最優(yōu)為2.63。使用發(fā)酵液干物質(zhì)、沉淀干物質(zhì)和豬糞作為飼料，黑水虻料重比均高于上清液干物質(zhì)組，分別為5.33、5.88、6.19。這可能是因?yàn)椋锨逡焊晌镔|(zhì)中含有各種黑水虻能高效利用的營養(yǎng)物質(zhì)，如小肽、氨基酸等，且含量較高，從而料重比較低；而豬糞粗蛋白含量較低僅為16.12%，黑水虻為攝取足夠營養(yǎng)必須大量采食，造成料重比偏高的情況。

2.10 黑水虻存活率（見圖9）

圖9 不同飼料對黑水虻存活率的影響

由圖9可見，上清液干物質(zhì)組黑水虻存活率最高，達(dá)到90.79%；其次為發(fā)酵液干物質(zhì)組，達(dá)到87.10%。沉淀干物質(zhì)組黑水虻存活率為84.89%，豬糞組黑水虻存活率最低為83.51%。這可能是因?yàn)椋i糞能產(chǎn)生氨氣、硫化氫等有毒氣體，還含有各種致病菌和蟲卵[11]，這些因素都可能對黑水虻的生長、健康產(chǎn)生負(fù)面影響。

3 結(jié)論

本文以羽毛降解率為指標(biāo)，從pH值、酶添加量、接種量、羽毛添加量和發(fā)酵時間共5個因素對角蛋白酶和蠟樣芽孢桿菌聯(lián)用降解羽毛的工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定適宜的生產(chǎn)條件為：pH值9.0、酶添加量2 000 U/g、接種量3.0%(v/v)、羽毛添加量2.5%、發(fā)酵時間為5 d。使用發(fā)酵上清液干物質(zhì)作為飼料養(yǎng)殖黑水虻幼蟲，能有效提高黑水虻幼蟲平均增重，優(yōu)化料重比，提高存活率。通過酶菌聯(lián)合處理羽毛，之后再飼喂黑水虻可能為羽毛等廢棄物資源化的新途徑。