□ 王成梅 張廣昊 山東濟(jì)寧中質(zhì)華檢測(cè)試檢驗(yàn)有限公司

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定蔬菜中6-芐基腺嘌呤的研究

□ 王成梅 張廣昊 山東濟(jì)寧中質(zhì)華檢測(cè)試檢驗(yàn)有限公司

本文建立了蔬菜中6-芐基腺嘌呤的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）的定性定量方法。樣品經(jīng)過(guò)甲醇水提取后，利用三重串聯(lián)四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析。樣品前處理只需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的分散和C18、ODS固相萃取凈化，離心后分析。利用超高效液相色譜進(jìn)行快速分離，采用MRM模式的電噴霧離子源串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。以0.5%的甲酸和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.4 mL/min.通過(guò)優(yōu)化得到較好的線性和較低的檢出限：線性范圍為0.01～10 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 5。該方法重現(xiàn)性和回收率很好，回收率為95.26%～107.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.82%～2.68%。該方法易用、快速、靈敏度高及結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于蔬菜中6-芐基腺嘌呤的分析研究。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；6-芐基腺嘌呤；蔬菜

6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine）是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，屬于人工合成的細(xì)胞分裂素，具有抑制植物體內(nèi)葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)分解，保綠防老的作用。目前主要應(yīng)用于蔬菜、水果的保鮮和無(wú)根豆芽的培育。它雖然在植物體內(nèi)含量甚微但是卻顯著影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和側(cè)芽的發(fā)育以及打破再生芽休眠[1]等。6-BA能提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，最終提高產(chǎn)率，常被用于促進(jìn)豆芽的生長(zhǎng)，提高煙葉的產(chǎn)量等。但是從食品安全的角度考慮，6-芐基腺嘌呤具有一定的毒性[2]。為了保證進(jìn)出口食品添加劑6-芐氨基腺嘌呤質(zhì)量和使用安全，維護(hù)消費(fèi)者的利益，建立一種快速準(zhǔn)確測(cè)定豆芽中6-芐氨基腺嘌呤質(zhì)量的方法，在生物化學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)和進(jìn)出口行業(yè)中都具有很重要的意義。目前6-芐基腺嘌呤的檢測(cè)方法主要有分光光度法[3]和高效液相色譜-紫外分析法[4]。對(duì)于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）的測(cè)定方法卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-MS/MS測(cè)定蔬菜中6-芐基腺嘌呤的定性和定量方法，該方法易用、快速、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠及成本低，適用于分析蔬菜中6-芐基腺嘌呤的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Agilent 6460液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）配有Agilent 1260高效液相色譜儀以及EI源，Secura513-1CN電子天平（美國(guó)賽多利斯），XW-80A渦旋振蕩器（上海醫(yī)大儀器廠），ASE-12固相萃取裝置，IKARRV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，IKA T25均質(zhì)器，北京普析 GWA-UN4-20純水機(jī)，微波萃取儀，SIGMA低溫離心機(jī)。

1.2 試劑

6-芐基腺嘌呤（純度＞98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司），甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司），C18，ODS。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Aglient ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm×2.1 mm 50mm），進(jìn)樣量：2 μL，流速：0.4 mL/min，柱溫：40 ℃，流動(dòng)相A：0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：甲醇，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

表2 6-芐基腺嘌呤質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)

1.3.2 質(zhì)譜條件

6-芐基腺嘌呤的檢測(cè)離子對(duì)、保留時(shí)間、解離電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。

1.4 樣品制備

精確稱(chēng)取完全混勻攪碎的樣品5 g（精確至0.001 g）置于50 mL的離心管中，加入4∶1的甲醇水，均質(zhì)，微波輔助萃取30 min，離心。稱(chēng)取0.2 mg C18和0.15 mg的ODS固相萃取吸附劑，離心后的上清液1 mL置于固相萃取吸附劑的離心管中，渦旋，離心，取上清液過(guò)膜上機(jī)待測(cè)。

圖1 Plus-C18柱和EC-C18柱比較

圖2 6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 6-芐基腺嘌呤在不同水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化

分別對(duì)Agilent ZORBAX Eclips e Plus-C18柱（1.8 μ m×2.1 m m 50mm）和Agilent Proshell 120 ECC18柱（2.7 μm 4.6 mm 50 mm），兩種不同的色譜柱進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱在峰型和出峰時(shí)間都比較理想，因此本實(shí)驗(yàn)選用ZORBAX Eclipse Plus-C18柱。同時(shí)為了優(yōu)化流動(dòng)相，考察了不同體系的流動(dòng)相，最終確定用甲酸水和甲醇做流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，分析目標(biāo)物的分離度和靈敏度較高。具體見(jiàn)圖1。

2.2 質(zhì)譜定性定量分析

根據(jù)6-芐基腺嘌呤的分子結(jié)構(gòu)特征，本實(shí)驗(yàn)選用電噴霧正離子模式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全掃描、子離子掃描和多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)，最終確定6-芐基腺嘌呤的母離子、子離子和最優(yōu)電壓以及碰撞能量。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別用酸化甲醇、酸化乙腈、甲醇水和乙腈水作為提取劑，最終確定甲醇水作為提取劑時(shí)效率高，而且從實(shí)驗(yàn)的角度來(lái)說(shuō)甲醇的毒性明顯要小于乙腈。因此，本實(shí)驗(yàn)最終確定以甲醇水作為提取劑。同時(shí)比較微波萃取和超聲提取，最終確定微波萃取作為提取方法。

2.4 線性和回收率的檢測(cè)

對(duì)一定范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，研究表明在0.03～10 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。線性方程為y=46 351.351 218x+35 781.794 881（見(jiàn)圖2）。樣品經(jīng)前處理后進(jìn)行分析，得到方法檢出限為0.1 μg/kg。通過(guò)蔬菜中添加6-芐基腺嘌呤做加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)。3個(gè)質(zhì)量濃度的加標(biāo)水平分別為：0.5、1.0、2.0 μg/kg，回收率和精確度見(jiàn)表3。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了蔬菜中6-芐基腺嘌呤的HPLC-MS/MS的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單實(shí)用、測(cè)定周期短、靈敏度高、回收率好以及選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣品的篩選檢測(cè)，為蔬菜中6-芐基腺嘌呤的提取提供了科學(xué)的依據(jù)。

[1]張平,郝建軍,于洋,等.GA3與6-BA復(fù)合劑對(duì)黃瓜產(chǎn)量的影響[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003,34(6):415-418.

[2]張瑩,鹿毅,楊濤,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定果蔬中7種植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑殘留量[J]分析測(cè)試學(xué)報(bào),2012(4):629-633.

[3]張志斌，張曉斌.凱氏定氮法測(cè)定6-芐基氨基嘌呤的含量[J].河南化工,2010(5):56-57.

[4]楊途熙,魏安智,鄭元,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定杏仁中8種植物激素[J].分析化學(xué),2007(9):1359-1361.

王成梅 (1984-),女，山東濟(jì)寧市，碩士。中級(jí)工程師。研究方向：食品檢測(cè)與分析。張廣昊（1990-），男，山東濟(jì)寧人，碩士。研究方向：食品檢測(cè)與分析。