田 晶，刁紅亮，馬瑞燕

（1.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西離石033000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

玫煙色棒束孢侵染對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)不同酶活的影響

田 晶1，2，刁紅亮2，馬瑞燕2

（1.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西離石033000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

對(duì)玫煙色棒束孢侵染煙粉虱成蟲(chóng)后其體內(nèi)的保護(hù)酶（超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT））和解毒酶（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE））的活力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，玫煙色棒束孢侵染煙粉虱成蟲(chóng)后，煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活力都受到明顯影響；SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活力在感病前期均有上升趨勢(shì)，且高于對(duì)照，在接菌48～60 h時(shí)酶活力達(dá)到最大，然后酶活力開(kāi)始下降，至84 h時(shí)均顯著低于對(duì)照?？梢?jiàn)，玫煙色棒束孢的侵染嚴(yán)重影響了煙粉虱正常的生理活動(dòng)。

玫煙色棒束孢；煙粉虱成蟲(chóng)；保護(hù)酶；解毒酶

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）廣泛分布在世界各地，因此，寄主范圍也相當(dāng)廣泛，包括同翅目、雙翅目、鞘翅目等[1]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究室在田間分離到1株玫煙色棒束孢菌株，經(jīng)過(guò)初步致病力測(cè)定，證明該菌對(duì)煙粉虱有較強(qiáng)的致病力[2]。

與大多數(shù)蟲(chóng)生真菌一樣，玫煙色棒束孢的菌絲也要穿透寄主的體壁才能對(duì)寄主進(jìn)行侵染。菌絲進(jìn)入寄主血腔后，會(huì)遭到寄主防御系統(tǒng)的抵抗[3]。在逆境脅迫下，昆蟲(chóng)體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）等多種抗氧化酶含量會(huì)發(fā)生變化，以抵御外界的侵害[4-5]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarE）能參與許多分子的解毒機(jī)制，在保護(hù)組織抵御氧化侵害中起重要作用[6-7]。在之前的研究中，對(duì)玫煙色棒束孢侵染煙粉虱2齡若蟲(chóng)后其體內(nèi)酶活進(jìn)行了測(cè)定[8]，玫煙色棒束孢同樣對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)有致病作用[2]。

為了進(jìn)一步了解煙粉虱成蟲(chóng)感染玫煙色棒束孢后體內(nèi)酶的變化規(guī)律，揭示其與玫煙色棒束孢侵染的相關(guān)性，本研究對(duì)感染玫煙色棒束孢的煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性進(jìn)行了測(cè)定，為進(jìn)一步研究玫煙色棒束孢對(duì)煙粉虱的侵染機(jī)制奠定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）IF-1106菌株。

供試?yán)ハx(chóng)：煙粉虱（Bemisia tabaci）。

1.2 菌液制備及試蟲(chóng)處理

菌液制備及成蟲(chóng)取樣方法參照煙粉虱致病力測(cè)定方法[2]。玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度為1.0× 107個(gè)/mL。成蟲(chóng)處理12 h后開(kāi)始取樣，每12 h取樣一次，取共7次。

1.3 酶液制備

將100頭成蟲(chóng)置于加有1mL 0.05mol/L PBS緩沖液研缽后，冰浴勻漿。勻漿液在4℃，12 000 r/min條件下冷凍離心20min，取上清液作為酶液。

1.4 酶活測(cè)定

1.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定 其按略改進(jìn)的Beauchamp等[9]的方法測(cè)定。3mL反應(yīng)體系：2.2 mL 0.05 mol/L PBS緩沖液，0.3 mL 130 mmol/L Met溶液，0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液，0.03 mL 10 mmol/L EDTA-Na溶液，0.12 mL 100 μmol/L核黃素溶液，酶液0.05 mL。將反應(yīng)液置于25℃，4 000 lx光照下反應(yīng)，30 min后用黑暗終止反應(yīng)，在560 nm下測(cè)定OD值，重復(fù)3次[10]。酶活性大小以單位時(shí)間單位蛋白的OD560變化值（U/mg）來(lái)表示。

1.4.2 過(guò)氧化物酶（POD）活力測(cè)定 其測(cè)定參照Simon等[11]的方法并略加改動(dòng)。首先取28 μL 30%的H2O2和19 μL的愈創(chuàng)木酚加入50 mL 0.05 mol/L PBS緩沖液（pH＝6.0），反應(yīng)時(shí)取上述混合溶液1mL與50 μL酶液混合，5 min后終止反應(yīng)。470 nm下測(cè)定5min前后的OD470值，以每分鐘單位蛋白OD470變化值（U/（mg·min））來(lái)表示酶活力大小。

1.4.3 過(guò)氧化氫酶（CAT）活力測(cè)定 其測(cè)定按李周直等[12]的方法略加改動(dòng)。1mL反應(yīng)液中含0.5mL 0.1 mol的H2O2和0.5 mL的酶液，對(duì)照以0.5 mL的PBS緩沖液代替酶液，30℃恒溫水浴10 min后加入0.5 mL 10%的H2SO4終止反應(yīng)，用0.1 mol的KMnO4滴定剩余的H2O2，記錄消耗的KMnO4量。酶活性用每毫克蛋白在10 min內(nèi)分解H2O2的量（mg）來(lái)表示。

1.4.4 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活力測(cè)定 其測(cè)定參照Habig[13]的方法，略有改動(dòng)。3mL反應(yīng)液中加入2.78 mL 0.05 mol/L PBS緩沖液，0.1 mL 0.02 mol的還原型谷胱甘肽和0.02mL 0.03mol/L的1-氯-2，4-二硝基苯和0.01 mL的酶液，在340 nm下記錄2min內(nèi)OD值的變化。酶活性大小以單位時(shí)間單位蛋白OD340變化值（U/（mg·min））來(lái)表示。

1.4.5 羧酸酯酶（CarE）活力測(cè)定 其測(cè)定參照Stumpf等[14]的方法，略有改動(dòng)。3.2 mL反應(yīng)液中加入0.05 mol/L PBS緩沖液0.45 mL，3×10-4mol/L的α-乙酸萘酯1.8 mL，0.05 mL酶液，30℃恒溫水浴15 min后加入0.9 mL 1%的固藍(lán)B鹽終止反應(yīng)，600 nm下測(cè)定OD值，重復(fù)3次。酶活性大小以單位時(shí)間單位蛋白OD600變化值（U/（mg·min））來(lái)表示。

1.4.6 酶液蛋白質(zhì)含量測(cè)定 其參照Bradford[15]的方法，用考馬斯亮藍(lán)G-250方法測(cè)定各酶液中蛋白質(zhì)的含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用成對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)法分析同一時(shí)間下處理與對(duì)照間酶活，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫煙色棒束孢侵染對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)SOD活力的影響

從圖1可以看出，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲(chóng)的SOD活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而對(duì)照的SOD活力基本不變。接種60 h后，處理組的煙粉虱成蟲(chóng)SOD活力達(dá)到最高，為301.77 U/mg，與對(duì)照組間差異顯著。此后，處理組SOD活力逐漸降低，至84 h時(shí)，SOD活力下降為114.90 U/mg。玫煙色棒束孢接種處理后，煙粉虱成蟲(chóng)SOD活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明煙粉虱成蟲(chóng)在感菌后，體內(nèi)SOD活力迅速提高以增強(qiáng)抵御能力，但SOD活力達(dá)到一定值后，菌體的入侵對(duì)蟲(chóng)體組織器官形成了干擾，影響昆蟲(chóng)正常的生理活動(dòng)，使其SOD分泌受到抑制，因此，酶活力開(kāi)始下降。

2.2 玫煙色棒束孢侵染對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)POD活力的影響

由圖2可知，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲(chóng)的POD活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而對(duì)照的POD活力基本上不變。接種48 h后，處理組的煙粉虱成蟲(chóng)POD活力達(dá)到最高，為14.96U/（mg·min），與對(duì)照組間差異顯著。此后，處理組POD活力逐漸降低，至84 h時(shí)，POD活力下降為2.51U/（mg·min）。成蟲(chóng)的POD活力呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，說(shuō)明煙粉虱成蟲(chóng)在受到玫煙色棒束孢的侵染后，體內(nèi)的POD不斷變化以適應(yīng)該菌的侵染，但到了侵染后期，可能由于玫煙色棒束孢菌絲的大量繁殖或產(chǎn)生一些毒素，POD的合成受到影響，從而使處理組酶活低于對(duì)照。

2.3 玫煙色棒束孢侵染對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)CAT活力的影響

從圖3可以看出，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲(chóng)的CAT活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而對(duì)照的CAT活力基本上不變。接種48 h后，處理組的煙粉虱成蟲(chóng)CAT活力達(dá)到最高，為4.87mg，與對(duì)照組間差異顯著。此后，處理組CAT活力逐漸降低，至84h時(shí)，CAT活力下降為1.95mg。CAT活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明在感病前期，其體內(nèi)的CAT活力升高以消除毒害的影響，但在侵染后期，蟲(chóng)體組織和物質(zhì)的代謝受到了嚴(yán)重的影響，蟲(chóng)體清除自由基的能力顯著下降。

2.4 玫煙色棒束孢侵染對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)GSTs活力的影響

從圖4可以看出，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲(chóng)的GSTs活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，而對(duì)照的GSTs活力基本保持不變。接種48 h后，處理組的煙粉虱成蟲(chóng)GSTs活力達(dá)到最高，為2.61U/（mg·min），與對(duì)照組間差異顯著。此后，處理組GSTs活力逐漸降低，至84 h時(shí)，GSTs活力下降為0.56U/（mg·min）。GSTs活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在侵染前期，蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶活力增加，以維持正常的生理活動(dòng)，在侵染后期，由于蟲(chóng)體組織發(fā)生病變，蟲(chóng)體解毒能力下降。

2.5 玫煙色棒束孢侵染對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)CarE活力的影響

從圖5可以看出，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲(chóng)的CarE活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，而對(duì)照的CarE活力基本上不變。接種48 h后，處理組的煙粉虱成蟲(chóng)CarE活力達(dá)到最高，為0.52 U/（mg· min），與對(duì)照組間差異顯著。此后，處理組CarE活力逐漸降低，至84 h時(shí)，CarE活力下降為0.11 U/（mg·min）。CarE活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在侵染前期，蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶活力增加，以維持正常的生理活動(dòng)，在侵染后期，由于蟲(chóng)體組織發(fā)生病變，蟲(chóng)體解毒能力下降。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，和煙粉虱2齡若蟲(chóng)一樣，煙粉虱成蟲(chóng)的保護(hù)酶（SOD，POD，CAT）和解毒酶（GSTs，CarE）都受到玫煙色棒束孢侵染的影響。煙粉虱感染玫煙色棒束孢后，其體內(nèi)SOD，POD，CAT，GSTs和CarE較正常蟲(chóng)體都有不同程度的變化，說(shuō)明感病煙粉虱體內(nèi)SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活性變化與玫煙色棒束孢的侵染有關(guān)。

昆蟲(chóng)體內(nèi)存在著抗氧化酶系統(tǒng)，在正常的條件下，SOD可以催化氧自由基變成H2O2，然后CAT和POD可將H2O2進(jìn)一步催化變成H2O。通過(guò)這些反應(yīng)可以消除昆蟲(chóng)體內(nèi)的自由基。但若抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，打破了細(xì)胞內(nèi)氧自由基的平衡，便會(huì)導(dǎo)致生物細(xì)胞內(nèi)氧自由基的濃度升高，自由基超強(qiáng)的氧化能力將破壞生物功能分子，使細(xì)胞功能受到破壞[16-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，侵染前期，煙粉虱體內(nèi)的3種保護(hù)酶活力迅速上升，被感染的煙粉虱體內(nèi)的自由基有所增多，機(jī)體迅速啟動(dòng)抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)消除自由基；但到了侵染后期，煙粉虱體內(nèi)的3種酶活力明顯降低，玫煙色棒束孢的侵染使蟲(chóng)體內(nèi)的抗氧化酶活性受到抑制，從而降低了對(duì)自由基的清除能力，這也許是導(dǎo)致煙粉虱感病死亡的重要原因之一。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarE）是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的解毒酶，其可以保護(hù)昆蟲(chóng)免受亞致死劑量的殺蟲(chóng)劑和其他毒素的危害。本研究結(jié)果表明，玫煙色棒束孢在侵染前期對(duì)蟲(chóng)體的GSTs和CarE有短暫的誘導(dǎo)作用，因此，在前48 h，GSTs和CarE活力有所增加，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲(chóng)體組織器官受到菌絲的破壞，使解毒酶的分泌受到影響，正常的生理代謝失衡，因此，酶活力顯著下降。

綜上所述，玫煙色棒束孢侵染對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性均有明顯影響。本研究從生化方面解釋了玫煙色棒束孢對(duì)煙粉虱正常的生理活動(dòng)的影響。今后還有必要通過(guò)石蠟切片和透射電鏡進(jìn)一步了解玫煙色棒束孢對(duì)煙粉虱的入侵機(jī)制。

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Effects of Isaria fum osorosea Infection on Different Enzyme Activities in the Adult in vivo of Bem isia tabaci

TIAN Jing1，2，DIAOHongliang2，MA Ruiyan2
（1.Departmentof Life Sciences，Lüliang University，Lishi 033000，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The activitiesofprotectiveenzyme（superoxide dismutase（SOD）,perioxidase（POD）,catalase（CAT））and detoxification enzyme（glutathione S-transferase（GSTs）,carboxylesterase（CarE））of adults of Bemisia tabaci infected by Isaria fumosorosea were studied.The results indicated that activities of SOD,POD,CAT,GSTs and CarE were significantly affected by Isaria fumosorosea.The activitiesofSOD,POD,CAT,GSTsand CarE increased after infection.These valueswere higher than control at the beginning of infection and reached their peaks in 48-60 h,then decreased and significantly lower than control in 84 h.Therefore,the physiological activities of Bemisia tabaci were disturbed by the infection of Isaria fumosorosea.

Isaria fumosorosea;adultof Bemisia tabaci;protectiveenzyme;detoxification enzyme

S433.39

A

1002-2481（2016）07-1007-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.27

2016-02-28

山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（FT201402）；北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（KFK-2015001）；呂梁學(xué)院校內(nèi)基金項(xiàng)目（ZRXN201409）

田 晶（1987-），女，山西浮山人，講師，博士，主要從事昆蟲(chóng)生理與生物防治研究工作。馬瑞燕為通信作者。