蔣慶科，鄒品田，羅勇為，陸海南，覃江克，鄒華紅

(1.廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004；2. 省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004；3. 桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西桂林541100)

?

QuEChERS-LC-MS/MS法測(cè)定黃皮果中30種常用農(nóng)藥殘留

蔣慶科1，2，鄒品田3，羅勇為3，陸海南1，2，覃江克1，2，鄒華紅1，2

(1.廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004；2. 省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004；3. 桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西桂林541100)

利用QuEChERS-LC-MS/MS法快速測(cè)定黃皮果中30種常用農(nóng)藥殘留。該法先采用乙腈從黃皮果中振蕩提取的各殘留農(nóng)藥，經(jīng)過(guò)PSA、無(wú)水MgSO4吸附凈化后，再利用LC-MS/MS檢測(cè)。結(jié)果表明：待測(cè)定的30種農(nóng)藥在5.0、10.0和20.0 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下，平均回收率56.3%～109.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.0%～10.7%，線性方程的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.996 7～0.999 9。該方法具有簡(jiǎn)便快捷、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，可為當(dāng)前黃皮果中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)試驗(yàn)提供參考依據(jù)。

QuEChERS; 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；黃皮果；農(nóng)藥殘留

0 引言

黃皮果Clausenalansium(Lour.) Skeels屬于蕓香科黃皮屬植物，因皮呈黃色而得名，又稱黃彈、黃枇等，主要分布于我國(guó)廣西、廣東、云南、海南等地區(qū)[1]。作為我國(guó)南方的一種特色水果，黃皮果色、香、味俱佳，與荔枝齊名，食用不但有助于消化，而且具有消積去滯、祛痰化氣、疏通腸胃等功效，深受廣大群眾喜愛(ài)[2]。在黃皮果種植過(guò)程中，不可避免地施用各種農(nóng)藥，這給人們的健康帶來(lái)潛在的危害。因此，黃皮果中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)不但對(duì)于市場(chǎng)上黃皮果的質(zhì)量控制，而且對(duì)于人們的健康保障具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前，農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)有很多，如氣相色譜法(GC)[3-4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[7]等。單一的高效液相色譜法與氣相色譜法在靈敏度和精確度上比較低，通過(guò)與質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS、LC-MS)很大地提升了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。而近年來(lái)出現(xiàn)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)不但在靈敏度、精確度、選擇性上進(jìn)一步超越了原有農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)，而且在復(fù)雜基質(zhì)、熱敏性物質(zhì)、農(nóng)藥多殘留檢測(cè)上具有顯著優(yōu)勢(shì)[8-10]。同時(shí)，在樣品檢測(cè)前處理的凈化技術(shù)上主要有QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)[11]、固相萃取(SPE)和凝膠色譜(GPC)等方法，而QuEChERS法相對(duì)于固相萃取(SPE)和凝膠色譜法(GPC)而言，操作快速、環(huán)保、簡(jiǎn)便，具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，有關(guān)黃皮果中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的研究很少，2006年呂岱竹等[12]報(bào)道了固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定黃皮果中的異菌脲殘留量，而黃皮果中多農(nóng)藥殘留的檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS法結(jié)合LC-MS/MS測(cè)定黃皮果中30種常用農(nóng)藥殘留，操作簡(jiǎn)便，成本低，靈敏度高，適用于大量樣品快速分析，旨在為當(dāng)前黃皮果農(nóng)藥多殘留體系的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Agilent 6495三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Milli-Q-Gard 1超純水儀(美國(guó)MILLIPORE公司)；梅特勒XS205分析天平，感量0.000 01 g(瑞士梅特勒)；TD5A臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)；HERMLE Z383K高速型離心機(jī)(萊比信科技發(fā)展有限公司)；超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

黃皮果(野生，廣西桂林市山區(qū)采摘)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：纈霉威、異丙甲草胺、毒死蜱、吡蟲(chóng)啉、殺撲磷、甲基硫菌靈、乙酰甲胺磷、三唑酮、甲霜靈、多菌靈、乙霉威、三唑醇、戊唑醇、霜霉威、多效唑、烯唑醇、三環(huán)唑、啶蟲(chóng)脒、嘧霉胺、丙環(huán)唑、己唑醇、烯酰嗎啉、惡霜靈、腈菌唑、氟苯脲、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、莠滅凈、嘧菌酯、異丙威，濃度均為100 mg/L(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取各濃度為100 mg/L農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液至容量瓶中，用乙腈定容稀釋至1.0 mg/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理

樣品提取：將樣品高速勻漿30 s，稱取20.00 g置于150 mL錐形瓶中，加入超純水10 mL，混勻震蕩1 min后，分別加入20 mL乙腈、8.00 g NaCl、2.00 g無(wú)水MgSO4，震蕩1 min后，離心。

樣品凈化：取上清液4 mL，移入裝有無(wú)水硫酸鎂1.00 g、N-丙基乙二胺 (PSA) 0.15 g的凈化離心管中，以1 000 r/min 旋混2 min (或以手劇烈振蕩提取1 min)，以4 000 r/min離心5 min，離心后取上清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸、0.1 mmol/L甲酸胺水溶液；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.4 mL/min。洗脫梯度：B初始體積分?jǐn)?shù)為10%；0～10 min，B體積分?jǐn)?shù)線性增加至95%；10～12 min，B保持體積分?jǐn)?shù)95%；12～15 min，回到初始狀態(tài)，并保持3 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電離模式：電子轟擊離子源(EI)；激活電壓：1.5 V；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：11 L/min；霧化氣壓力：2.757 9×105Pa；毛細(xì)管電壓：3 500 V；鞘流氣溫度：350 ℃；鞘流氣流速：12 L/min。數(shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

選擇QI全掃描，結(jié)果顯示在正離子(ESI+)掃描模式下，所有組分的響應(yīng)值優(yōu)于負(fù)離子(ESI-)掃描模式，靈敏度較高。為避免某些組分色譜峰重疊的干擾，選取化合物的2個(gè)離子對(duì)分別用于定性和定量。

2.2 色譜條件的確定

采用LC-MS/MS法進(jìn)行農(nóng)藥檢測(cè)，流動(dòng)相考察了甲醇/水體系、乙腈/水體系、甲醇/甲酸銨-甲酸水體系、乙腈/甲酸銨-甲酸水體系，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入甲酸銨-甲酸可以使農(nóng)藥在正離子模式下得到更好的電離，乙腈/甲酸銨-甲酸水體系的分離效果優(yōu)于甲醇/甲酸銨-甲酸水體系，且提取過(guò)程采用的是乙腈做提取劑，所以本研究最終采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，以含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸、0.1 mmol/L甲酸銨的水溶液(A)與含體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸的乙腈溶液(B)為流動(dòng)相，具體梯度設(shè)置見(jiàn)1.2.2。

表1 30種農(nóng)藥的LC-MS/MS檢測(cè)條件

2.3 前處理優(yōu)化

2.3.1 萃取溶劑的選擇

一般農(nóng)藥殘留檢測(cè)提取溶劑為正己烷、丙酮、乙腈。通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察，使用丙酮時(shí)分層不明顯；正己烷對(duì)一些極性較大的農(nóng)藥組分的溶解性差，致使回收率降低，同時(shí)，需置換溶劑，步驟繁瑣，不能達(dá)到快速檢測(cè)的目的；而乙腈的穿透性強(qiáng)，對(duì)極性大的與極性小的農(nóng)藥溶解性均強(qiáng)，對(duì)多種殘留農(nóng)藥都能較完全提取。通過(guò)對(duì)比，最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 氯化鈉的用量

加入過(guò)量氯化鈉，溶液達(dá)到飽和，可以使乙腈相與水相具有較好的分層效果，同時(shí)能使樣品中的膠體聚沉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，前處理加入10 mL水時(shí)，加入8 g氯化鈉較為適宜。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

大量研究表明，不同植物體內(nèi)的基質(zhì)對(duì)分析物的離子化有著增強(qiáng)或者抑制效應(yīng)，為此，采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法減弱基質(zhì)效應(yīng)，溶劑匹配混合標(biāo)液和基質(zhì)匹配混合標(biāo)液的總離子流圖見(jiàn)圖1、圖2。由圖可以看出，基質(zhì)對(duì)分析物的離子化具有一定影響。

圖1 MRM模式下乙腈溶劑混合標(biāo)液的總離子流圖Fig.1 The total ion flow diagram of acetonitrile mixed standard solution under MRM mode

圖2 MRM模式下黃皮果基質(zhì)匹配混合標(biāo)液的總離子流圖Fig.2 The total ion flow diagram of chinese wampee matching mixed standard solution under MRM mode

2.5 線性關(guān)系和檢出限

在優(yōu)化的條件下進(jìn)行方法學(xué)考察。用空白樣品的提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，將目標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0及50.0 μg/kg，進(jìn)樣2 μL，以MRM定量離子的色譜面積為縱坐標(biāo)(Y)，以目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)(X)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)，結(jié)果如表2所示?？梢?jiàn)，在0.5～50.0 μg/kg，各組分的峰面積與質(zhì)量濃度成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.995，可用于定量檢測(cè)。

2.6 回收率和精密度

農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的回收率和變異系數(shù)(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)用于考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，一般采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定。取已制備均勻的空白樣品，準(zhǔn)確加入多種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備加標(biāo)水平分別為5.0、

表2 30種常用農(nóng)藥的線性關(guān)系

10.0、20.0 μg/kg的樣品各5份，按上述優(yōu)化后的方法提取、凈化樣品，并進(jìn)行LC-MS/MS分析，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，計(jì)算平均回收率和變異系數(shù)，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，30種常用農(nóng)藥的平均回收率為56.3%～109.0%，相對(duì)偏差為1.0%～10.7%，均在可允許范圍內(nèi)。乙酰甲胺磷在3個(gè)水平的回收率分別為57.7%、57.2%和56.3%，回收率偏低，可能是由于其極性偏大，在水中的溶解度大，難以萃取至乙腈相中，但其相對(duì)偏差在2.6%～6.6%的范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

表3 3個(gè)水平下的農(nóng)藥的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)建立了黃皮果中30種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法，不但實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)一次提取、快速凈化，而且具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)檢測(cè)，30種常用農(nóng)藥在3個(gè)添加水平下的平均回收率為56.3%～109.0%，相對(duì)偏差為1.0%～10.7%，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，線性方程的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.996 7～0.999 9，適用于黃皮果中多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

[1] 李昌寶，游向榮，孫健，等. 超聲強(qiáng)化提取山黃皮果總黃酮及其抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33(5)： 265-268.

[2] 蘇秀芳. 超聲波輔助法提取山黃皮果仁中的總黃酮[J]. 食品科技，2011， 36(2)： 220-223.

[3] RAHMAN M M， JANG J， PARK J H， et al. Determination of kresoxim methyl and its thermolabile metabolites in pear utilizing pepper leaf matrix as a protectant using gas chromatography[J]. Journal of Advanced Research， 2014， 5(3)： 329-335.

[4] ABREUA S D M， CABONIB P， CABRASB P， et al. Validation and global uncertainty of a liquid chromatographic with diode array detection method for the screening of azoxystrobin， kresoxim-methyl， trifloxystrobin， famoxadone， pyraclostrobin and fenamidone in grapes and wine[J]. Analytica Chimica Acta， 2006， 573/574： 291-297.

[5] 王潔蓮，董燕飛. 高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)蔬菜中7種農(nóng)藥殘留方法的分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31(12)： 267-272.

[6] LIU X G， DONG F S， QIN M， et al. Residue analysis of kresoxim-methyl and boscalid in fruits，vegetables and soil using liquid extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Biomedical Chromatography， 2010， 24(4)： 367-373.

[7] 陳溪，程磊，曲世超，等. QuEChERS-液相色譜-質(zhì)譜法快速篩查和確證大米中205種農(nóng)藥殘留[J].色譜，2015，33(10)： 1080-1089.

[8] 旭凌，李壹，熊曉輝.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)橘子中10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程，2015，15(9)： 10-14，38.

[9] 林童，魏玉海，鳳曉博，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定枸杞中常見(jiàn)的5種農(nóng)藥殘留[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2015， 14(1)： 37-39，49.

[10] 粟有志，李芳，李艷美，等.固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葡萄干中105種農(nóng)藥殘留[J]. 分析試驗(yàn)室，2015，34(4)： 433-441.

[11] 王連珠，黃小燕，陳泳，等.QuEChERS前處理-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定果蔬中18種弱酸性農(nóng)藥殘留[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2014， 33(10)：1102-1108.

[12] 呂岱竹，韓紅新. 用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)黃皮果中的異菌脲殘留量[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2006，27(4)： 101-103.

(責(zé)任編輯 王龍杰)

Determination of 30 Kinds of Pesticide Residues in Fruit of Chinese Wampee by QuEChERS-LC-MS/MS Method

JIANG Qingke1，2， ZOU Pintian3， LUO Yongwei3，LU Hainan1，2， QIN Jiangke1，2， ZOU Huahong1，2

(1. School of Chemistry and Pharmacy， Guangxi Normal University， Guilin Guangxi 541004， China; 2. State Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources， Guangxi Normal University， Guilin Guangxi 541004， China; 3. Guilin Layn Natural Ingredients Corp， Guilin Guangxi 541100， China)

30 kinds of pesticide residues in wampee were determined rapidly by the method of QuEChERS-LC-MS/MS. In this method， the pesticide residues were extracted from the fruits of Chinese Wampee by shaking with acetonitrile firstly， and then purified by PSA and anhydrous MgSO4， finally the sample solvents were detected by LC-MS/MS. The results showed： the average recovery of 30 pesticides ranged from 56.3% to 109% in the spiked level of 5， 10， 20 μg/kg， with relative standard deviation from 1.0% to 10.7%， and the correlation coefficient of the linear equation can reach 0.996 7 to 0.999 9. This method is simple but with low cost and high efficiency， and can provide reference for multiple pesticides residue in wampee detection tests.

QuEChERS; LC-MS/MS;Clausenalansium(Lour.) Skeels; pesticide residue

10.16088/j.issn.1001-6600.2016.03.015

2016-04-20

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻12118008-10)；桂林市科技計(jì)劃項(xiàng)目(20140111-2)

覃江克(1977—)，男，廣西大化人，廣西師范大學(xué)教授，博士。E-mail: jiangkeq@sina.com

O641

A

1001-6600(2016)03-0109-07