黃遠潔，李衛(wèi)東，莫肖敏

(廣西醫(yī)科大學醫(yī)學科學實驗中心電鏡室，廣西南寧530021)

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植物內(nèi)生菌透射電鏡負染標本制備方法的對比研究

黃遠潔，李衛(wèi)東，莫肖敏

(廣西醫(yī)科大學醫(yī)學科學實驗中心電鏡室，廣西南寧530021)

通過比較4種不同方法處理的植物內(nèi)生菌負染標本的透射電鏡檢測結果，探討植物內(nèi)生菌透射電鏡負染標本的理想制備方法。采用直接刮取法、雙蒸水沖洗法、雙蒸水沖洗離心重懸法和雙蒸水沖洗靜置法制備菌懸液，應用10 g/L磷鎢酸漂浮法負染，透射電子顯微鏡檢測，根據(jù)菌的形態(tài)特征及菌毛、鞭毛形狀數(shù)量等指標判斷取材及處理方法的各自優(yōu)缺點。結果顯示：直接刮取法的樣品原始狀態(tài)保存較好，但雜質(zhì)多，背景重；雙蒸水沖洗的樣品背景較干凈；雙蒸水沖洗離心重懸法和雙蒸水沖洗靜置法的樣品視野清晰、分布均勻，背景干凈、雜質(zhì)少，但前者菌的形態(tài)結構較易受影響。可見，透射電鏡是植物內(nèi)生菌檢測的重要工具，需根據(jù)實際情況選用樣品制備方法。在嚴格控制靜置時長的前提下，雙蒸水沖洗靜置法制備菌懸液后應用負染技術可獲得較理想的檢測效果。

植物內(nèi)生菌；透射電鏡；負染

100多年前人們就已發(fā)現(xiàn)在健康植物組織的內(nèi)部存在微生物，1866年德國科學家De Bary提出了“內(nèi)生菌”(Endophyte)一詞。1992年美國科學家Kloepper第一次提出了“植物內(nèi)生菌”的概念，即是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康高等木本、草本植物，單子葉植物和雙子葉植物各種組織和器官內(nèi)部的真菌或細菌，主要包括內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)、內(nèi)生細菌(Endophytic bacteria)和內(nèi)生放線菌(Endophytic actinomyces)三大類。

近年來，植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源受到了廣泛的關注，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌能增強宿主抵御病害的能力，還可以分泌抗生素、毒素等代謝物質(zhì)誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性(Induced Systemic Resistance，ISR)，起到生物防治效果，此外，其代謝產(chǎn)物有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用。從內(nèi)生菌中尋找和發(fā)現(xiàn)新的活性化合物已成為國內(nèi)外研究的又一熱點[1]，具有良好的應用前景。廣西植物資源豐富，是植物內(nèi)生菌研究領域的寶貴資源庫，充分利用各種研究工具推動和促進植物內(nèi)生菌的研究對廣西的科研及經(jīng)濟發(fā)展具有十分重要的意義。

透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope，TEM)簡稱透射電鏡，能直觀、準確地檢測動植物組織細胞的超微結構改變[2-3]，是醫(yī)學生物學研究的重要工具。其中，利用重金屬鹽溶液如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾等進行負染色反襯出透亮的樣品，在電鏡下可快速完成樣品的檢測，是研究植物內(nèi)生菌的重要手段。本實驗室采用4種方法分別進行植物內(nèi)生菌的電鏡負染標本制備，對染色結果進行綜合對比分析，總結4種方法的優(yōu)缺點及注意事項，以期在今后的植物內(nèi)生菌檢測工作中獲得滿意的電鏡檢測結果。

1 材料與方法

1.1 材料

植物內(nèi)生芽孢桿菌和假單胞菌(廣西農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所岑貞陸副研究員惠贈)，外徑3 mm，孔徑80 μm銅網(wǎng)(ZB-AZH200，北京中興百瑞技術有限公司)，10 g/L磷鎢酸染液(美國SPI公司)。

1.2 儀器

日立H-7650型透射電鏡(日本日立公司)。

1.3 方法

按以下4種方法分別制備菌懸液后，立即吸取約20 μL菌液滴于蠟板上，用鑷子夾取外徑3 mm，孔徑80 μm銅網(wǎng)，支持膜面覆扣于菌液滴上2 min，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體，滴加約20 μL 10 g/L磷鎢酸染液于蠟板上，將銅網(wǎng)帶菌樣品面朝下覆扣于染液滴上各染色5～120 s，用濾紙吸去染液，自然晾干后進行電鏡檢測采圖。

1.3.1 直接刮取法：高壓滅菌的竹簽輕輕刮取培養(yǎng)皿中瓊脂上的單菌落，放入裝有雙蒸水的5 mL離心管中，用一次性吸管輕柔吹打混懸菌液備用。

1.3.2 雙蒸水沖洗法：用一次性吸管吸取雙蒸水，緩緩沖洗培養(yǎng)皿中瓊脂上的單菌落至5 mL離心管中，輕柔吹打混懸菌液備用。

1.3.3 雙蒸水沖洗離心重懸法：用一次性吸管吸取雙蒸水，緩緩沖洗培養(yǎng)皿中瓊脂上的單菌落至5 mL離心管中，輕柔吹打后1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入雙蒸水重懸菌液備用。

1.3.4 雙蒸水沖洗靜置法：用一次性吸管吸取雙蒸水，緩緩沖洗培養(yǎng)皿中瓊脂上的單菌落至5 mL離心管中，靜置5 min后，吸取上清菌液備用。

2 結果及分析

在取材和制備菌懸液樣品方面，4種電鏡負染標本制備方法各有優(yōu)劣，詳見表1。而在負染方面，染色時間也十分關鍵，染色時間為2 min的樣品菌體著色較重，鞭毛著生部位及菌膜結構較難辨別(圖1E、F)，而染色時間為10 s的樣品著色效果較理想，菌體表面結構清楚，鞭毛清晰可辨(圖1G、H)。

表1 4種透射電鏡負染樣品制備方法比較

A.直接刮取法樣品；B.雙蒸水沖洗法樣品；C.蒸水沖洗離心重懸法樣品；D.雙蒸水沖洗靜置法樣品；E.染色時間2 min的芽孢桿菌；F.染色時間10 s的芽孢桿菌；G染色時間2 min的假單胞菌；H.染色時間10 s的假單胞菌圖1 H-7650透射電鏡下4種方法樣品制備的結果Fig.1 Results of the samples prepared by 4 kinds of methods under H-7650

3 討論

截至2010年，在各種農(nóng)作物及經(jīng)濟作物中發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生細菌已超過129種，分屬于54個屬，主要為假單胞菌屬Pseudomonas、腸桿菌屬Enterobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、土壤桿菌屬Agrobacterium、克雷伯氏菌屬Klebsiella、泛菌屬Pantoea、甲基桿菌屬Methylobacterium等。內(nèi)生真菌主要為子囊菌類Ascomycet及其無性型，包括核菌綱Pyrenomyetes、盤菌綱Discomyetes和腔菌綱Loculoascomyetes等。內(nèi)生放線菌主要為鏈霉菌屬Streptomyces、鏈輪絲菌屬Streptoverticillum、游動放線菌屬Antinoplanes、諾卡氏菌屬Nocardia、小單孢菌屬Micromonospora等。隨著各研究領域?qū)χ参飪?nèi)生菌的深入研究，植物內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[4]、醫(yī)藥研究應用[5]、生物防治[6]、環(huán)境改造[7]等方面將大放異彩。透射電鏡作為植物內(nèi)生菌鑒別研究的重要工具，能通過負染技術快速對內(nèi)生菌進行檢測鑒別，成為科研工作者內(nèi)生菌形態(tài)學研究的首選。

本實驗室對4種常用內(nèi)生菌電鏡負染標本制備方法進行了比較總結。其中，直接刮取法的步驟簡單，在刮取適當?shù)那闆r下可較好地保持菌的原始狀態(tài)，故在需要重點觀察菌落整體情況和菌落中的菌與菌之間的表面情況時可選用該法進行快速初步的觀測。部分對沖洗、離心等外界施加因素敏感的菌采用此法也能減少人工假象。雙蒸水沖洗法相對簡便，能減少直接刮取法所導致的培養(yǎng)基雜質(zhì)和細胞碎片附著于菌體的情況，改善采圖效果。雙蒸水沖洗離心重懸法需要針對菌的耐受性進行離心速度和時間的摸索，制樣成本增加且耗時較長，但樣品背景干凈，視野清晰，故對沖洗及離心耐受性較好的菌采用此法效果較佳。雙蒸水沖洗靜置法其優(yōu)勢在于雙蒸水沖洗下來的菌體短暫靜置后，單個菌體能浮動至上清液中，不需離心重懸即可獲得干凈的單個菌體，在嚴格控制菌靜置時間的前提下對菌的影響相對較小，是理想的樣品制備方法。此外，除了染色的時間長短，負染的時機對樣品最后的成像也十分重要，覆扣于菌液的銅網(wǎng)用濾紙吸去多余的菌液后，需等到肉眼看不到殘留的液體時再覆扣于染液上進行染色，否則樣品完全干了之后染色會出現(xiàn)大片顆粒性團塊附著影響觀測，而在肉眼可見菌液水珠時進行染色，則會出現(xiàn)邊緣效應影響染色結果。

綜上所述，透射電鏡是植物內(nèi)生菌檢測的重要工具，根據(jù)實際情況選用不同的負染標本制備方法，能大大提高標本制備的成功率。在嚴格控制菌靜置時間的前提下，雙蒸水沖洗靜置法是較理想的樣品制備方法。

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(責任編輯 馬殷華)

Comparative Study on the Preparation Methods of Transmission Electron Microscope Negative Staining Specimens for Plant Endophyte

HUANG Yuanjie， LI Weidong， MO Xiaomin

(Electron Microscope Laboratory of the Medical and Scientific Research Center， Guangxi Medical University， Nanning Guangxi 530021， China)

The results of transmission electron microscope tests of the negative staining specimens of plant endophyte were comparatively studied to explore the ideal preparation methods of transmission microscope negative staining specimens of plant endophyte. Firstly, four methods were used to prepare endophyte suspension, such as direct scraping, double distilled water flushing, double distilled water flushing followed by centrifugal separation and re-suspension and double distilled water flushing followed by static placing. Then, 10 g/L phosphotungstic acid was applied for floating negative staining and the transmission electron microscope test was carried out. And finally, the morphological characteristics, the shape and the quantity of the pilus and the flagellum of the endophyte were used as indicators to assess the advantages and disadvantages of these extracting and processing methods. Results: (1) The original state of the direct scraping sample is better, but the background is heavy, and the surface of the cell is affected easily by impurities. (2) The sample background of the double distilled water flushing is better. (3) The sample of the double distilled water flushing followed by centrifugal separation and re-suspension, and the sample of the double distilled water flushing followed by static placing have a clear vision, uniform distribution, clean background and less impurity under the transmission electron microscope. But the morphology structure of endouphyte of the former one was more easily affected. Transmission electron microscopy is an important tool for endophyte research. However, it is necessary to choose sample processing methods based on the actual situation. Under strict control of the static time, double distilled water flushing followed by static placing with the negative staining technique can achieve better test results.

plant endophyte；transmission electron microscope; negative staining

10.16088/j.issn.1001-6600.2016.03.018

2016-01-27

國家自然科學基金資助項目(81560608)；廣西自然科學基金資助項目(2015GXNSFAA139123)；廣西醫(yī)科大學青年科學基金資助項目(GXMUYSF2014022)

黃遠潔(1979—)，女，廣西北海人，廣西醫(yī)科大學助理研究員，博士。E-mail：renee927@126.com

Q93-33

A

1001-6600(2016)03-0127-04