杭 婧 馮曉青 胡曉抒

(1.南京醫(yī)科大學(xué)，南京 211166；2.淮安市食品藥品檢驗所， 淮安 223300；3.淮安市疾病預(yù)防控制中心，淮安 223001)

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高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測定動物源性中藥材中無機汞和甲基汞

杭 婧1,2馮曉青3胡曉抒1*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)，南京 211166；2.淮安市食品藥品檢驗所， 淮安 223300；3.淮安市疾病預(yù)防控制中心，淮安 223001)

目的：建立動物源性中藥材中汞和甲基汞的檢測方法。方法：從0.5g中藥材中萃取汞(Hg)化合物，通過向0.2g凍干的樣品材料加入50mL水1%w/v的L-半胱氨酸·HCl·H2O，在玻璃小瓶中60 ℃下加熱120 min。50μL汞化合物提取物經(jīng)過濾后注入反相液相色譜儀，經(jīng)C-18柱、流動相含水0.1%w / v L-半胱氨酸·HCl·H2O +0.1%w / v的L-半胱氨酸，室溫下分離，并通過電感耦合等離子體-質(zhì)譜法在質(zhì)荷比202檢測?？偣癁榧谆蜔o機汞提取物之和。結(jié)果：中藥材樣品中甲基汞在0.055～2.78 mg·kg-1范圍，無機汞在0.014～0.137 mg·k-1范圍內(nèi)兩者精密度即相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為≤5%和≤9%。目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率甲基汞為78.0%～98.8%，無機汞為87.3～94.5%。參考樣品中的甲基汞和總汞與標(biāo)準(zhǔn)值一致。甲基汞和無機汞在中藥材中的定量下限分別為0.007 mg·kg-1和0.005 mg·kg-1。結(jié)論：分析物的穩(wěn)定性評價證實L-半胱氨酸既能穩(wěn)定又能對甲基汞脫烷基化，這些都取決于半胱氨酸的濃度和穩(wěn)定時間。聚丙烯會對甲基汞穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。

動物源性中藥 汞、甲基汞 HPLC-ICP-MS

1 引言

甲基汞可在水生生物體內(nèi)富集，并通過食物鏈傳遞最終影響暴露人群[1-3]。通過生物放大作用，水生動物內(nèi)甲基汞的濃度可達到水體中濃度的104～106倍[4-6]，從而對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。中藥材中有很多水生動物源性中藥材，這類藥材是很多治療藥物及保健品的原材料，長期使用會對人群造成危害。

現(xiàn)在有機汞的主要檢測方法有原子熒光光譜法、氣相色譜法、ICP-MS法[7-10]等。雖然有機汞的氣相色譜法檢測速度較快，然而電子捕獲檢測器檢測汞的專屬性不強，雜質(zhì)干擾較多。

在國際上的甲基汞檢測方法中，主要是采用氯仿將甲基汞酸化的海鮮中萃取出來，通過硫代硫酸鈉水溶液和通過反相量化，通過帶有內(nèi)部熱解析裝置的高效液相色譜耦合原子吸收光譜檢測[11]。但此類方法有較多缺點：(a)使用有害的有機溶劑；(b)較難除去干擾化合物；(c)玻璃器皿反復(fù)提取耗時耗力；(d)色譜柱的原因結(jié)果很難再現(xiàn)。液相色譜-AAS法的最大缺點是熱解吸裝置中的洗脫液收集物發(fā)生碳化會阻塞HPLC流動相。

常規(guī)分析中常采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測水溶液中超痕量重金屬分析，而且HPLC新的固定相可以相提供優(yōu)異的色譜性能，同時還可以采用pH值較低的100%水流動相。Beauchemin等使用ICP-MS測定生物材料中的甲基汞[12]，甲基汞被從酸化物質(zhì)中萃取至甲苯中，通過流動注射裝置輸入ICP-MS以減少在火炬噴油器和質(zhì)譜儀接口處的溶解固體沉積；Wan等向樣品中加入半胱氨酸，并使用HPLC和ICP-MS聯(lián)用，通過氣體發(fā)生裝置來確定含水樣品中甲基，乙基和無機汞化合物的含量[13]；RAI等用ICP-MS直接連接高效液相色譜測定在酶促水解海鮮的含半胱氨酸水提取物中的甲基汞和無機汞[14]；Gill等通過在半胱氨酸和氫氧化鈉的存在下加熱樣本從海鮮和頭發(fā)中提取無機和其他汞化合物[15]。

本研究目的是通過優(yōu)化改進前處理方法來建立測定動物源性中藥材中甲基汞和無機汞的HPLC-ICP-MS方法。目標(biāo)包括：(a)消除使用有害溶劑，減少繁瑣的樣品制備步驟，溶液引入設(shè)備如流動注射，(b)確定甲基汞檢出限≥0.1 mg kg-1，(c)提供動物源性中藥材及相關(guān)樣品合適的檢測方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：XⅡ型( Thermo Fisher)；高效液相色譜儀(安捷倫1260)，帶C18色譜柱；超純水儀(Millipore-Q)；研磨器(英國Joseph公司)；冷凍干燥機(上海喬躍公司)。氧化汞(光譜純，德國Merck公司)；甲基汞標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)；鹽酸(優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司) ；超純水(屈臣氏再處理水)；L-半胱氨酸(優(yōu)級純)。

2.2 儀器工作條件

Agilent Zorbax Plus C18色譜柱，4.6mm × 150mm×5μm；液相色譜條件見表1，ICP-MS見表2。

表1 液相色譜條件

表2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀參數(shù)

2.3 樣品處理

每種中藥材充分粉碎后分為兩份，采用冷凍干燥機進行干燥48 h，待充分干燥后置于棕色玻璃瓶中，封口膜封口，4 ℃保存。

準(zhǔn)確稱取0.5 g 中藥材于60mL 的棕色萃取瓶，共6份，每個樣品加入50±0.5 mL 0.1%w / v的L-半胱氨酸·HCl·H2O萃取溶液到萃取小瓶中，小瓶蓋緊，用手劇烈搖動15～20s，放置于保持在60±4℃水浴中；小瓶加熱后的60和120 min用手劇烈搖動15～20或更多次，蓋緊小瓶將其在22±5 ℃水中放置10～15 min冷卻至室溫；之后立即將提取小瓶冷卻至室溫，取2～3 mL提取物進行過濾，最初1～1.5 mL萃取液丟棄，最后1～1.5 mL提取液收集在玻璃自動進樣瓶中用于通過HPLC-ICP/MS分析，提取液置于進樣瓶避光儲存直至分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取液，溫度和時間的選擇

以往的研究證明，通過與L-半胱氨酸的水溶液加熱可以從海藻[14]和頭發(fā)[15]產(chǎn)品中萃取甲基汞。前期實驗摸索了半胱氨酸的濃度，溫度和提取時間對中藥加標(biāo)樣品中的甲基汞提取效率的影響(表3)。研究顯示最佳條件是聚丙烯管中每0.1～0.5克產(chǎn)物加入25～50 mL提取液。

表3 初步試驗條件

序號提取條件甲基汞提取樣品加標(biāo)(%回收率)空白加標(biāo)(%回收率)10.05%w/v的L-半胱氨酸·HCl·H2O,勻漿1min,等待60min,室溫――2同1溶液,加入HCl(0.9%0.9%v/v),立即進行分析――3同1,加熱60～70℃8min――4同1,加入HCl(0.3%v/v),加熱60～70℃8min――510%V/V鹽酸,勻漿1分鐘,等待60min,室溫―<5%(≥100%)60.05%w/vL-半胱氨酸·HCl·H2O,搖15s,60℃加熱15min92(28)―70.05%w/VL-半胱氨酸·HCl·H2O,搖15s,60℃加熱30min74(28)―80.05%w/vL-半胱氨酸·HCl·H2O,搖15s,60℃加熱60min73(29)―90.05%w/vL-半胱氨酸·HCl·H2O,搖15s,60℃加熱120min72(31)―100.05%w/vL-半胱氨酸·HCl·H2O,搖15s,60℃加熱180min77(33)100(99)110.05%w/vL-半胱氨酸·HCl·H2Oa,搖15s,60℃加熱15min75(56)100(99)120.05%w/v的L-半胱氨酸·HCl·H2O,加0.2%V/V鹽酸,搖15s,60℃加熱120min94(46)98(98)130.05%w/v的L-半胱氨酸·HCl·H2O,加0.4%V/V鹽酸,搖15s,60℃加熱120min95(52)100(101)140.05%w/v的L-半胱氨酸·HCl·H2Ob,搖15s,60℃加熱15min92(100)99(100)

a: 0.05%w / v的L-半胱氨酸·HCl·H2O的提供約0.01%v / v鹽酸的當(dāng)量；b: 0.5%w / v的L-半胱氨酸·HCl·H2O提供大約0.1%v/v鹽酸的當(dāng)量。

在實驗5中，流動相中加入0.05%w/v的乙酸銨緩沖溶液。在實驗1～5中，產(chǎn)品和萃取溶液在萃取前預(yù)先混合1 min，萃取液離心并于分析前過濾。在實驗6～14，提取通過用手用力搖晃；需要提取分析之前僅過濾。表3結(jié)果表明當(dāng)提取液額外加入HCl(實驗2)或加熱(實驗3)，用0.05% w/v L-半胱氨酸·HCl·H2O提取的甲基汞略有增加。當(dāng)加入鹽酸并加熱時(實驗4)甲基汞提取量約增加一倍。在實驗方法5中方法空白在光線中甲基汞脫烷基非常明顯，最初的實驗也證明在玻璃瓶內(nèi)加熱鹽酸的提取方法是穩(wěn)定的。實驗5中空白實驗的脫烷基化取決于存不存在含硫化合物比如提取過程中使用的半胱氨酸[16]。研究顯示半胱氨酸可以穩(wěn)定甲基汞，報道指出通過加入L-半胱氨酸可使石英瓶中暴露于UV的HCl溶液中的甲基汞脫烷基減緩。通過與0.05%w/v的L-半胱氨酸·HCl·H2O進行較長時間的加熱，以圖顯著提高甲基汞萃取效率獲得部分成功。在6～7實驗中加熱時間增長，在8～10實驗中甲基汞的提取量增加。此外，在實驗10中甲基汞和無機汞都能從空白實驗中定量回收。實驗9中選取加熱條件為(60℃和120 min)，結(jié)果沒有因為增加加熱時間而提高。盡管在實驗11～13中添加鹽酸可以提高加標(biāo)水產(chǎn)品中甲基汞的回收量，但無機汞的回收率較低。在實驗14結(jié)果中回收率提高的最主要因素是L-半胱氨酸·HCl·H2O濃度的增加。實驗選取1% w/v L-半胱氨酸·HCl·H2O溶液60 ℃加熱120 min，而濃度更高的半胱氨酸不能繼續(xù)提高甲基汞回收率。

3.2 萃取容器材料的選擇

以往的研究證明，甲基汞存儲在1%鹽酸的聚乙烯容器中不穩(wěn)定但存儲在玻璃中較穩(wěn)定[11]。因此實驗驗證了使用聚丙烯或玻璃萃取容器的效果。

分別在玻璃和聚丙烯試管中加入樣品，添加50 mL 1%w / v的L-半胱氨酸·HCl·H2O提取液60℃加熱120 min。圖1結(jié)果顯示提取0.2～0.5g樣品比提取1g時采用玻璃試管比聚丙烯效果要好的多。本項目選擇使用玻璃瓶以及0.5 g樣品作為前處理指標(biāo)參數(shù)。不使用0.2 g樣品是由于其均質(zhì)性比0.5 g差。實驗中采用棕色玻璃瓶進行提取可有效避免光線照射。

3.3 甲基汞和無機汞的穩(wěn)定性

實驗完成后，在實驗室的室溫和照明環(huán)境下觀察儲存在聚丙烯試管中濃度為(1000 μg/L)標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性。1%的w/v L-半胱氨酸·HCl·H2O作為溶劑，因為它是作為提取液和標(biāo)準(zhǔn)系列的配制溶液，混標(biāo)中含有相同濃度的兩種汞標(biāo)準(zhǔn)溶液。對溶液連續(xù)測定96 h，因為標(biāo)準(zhǔn)溶液從周一配制完成，從周二到周五連續(xù)測定。儲存在聚丙烯塑料瓶1% L-半胱氨酸·HCl·H2O中的所有甲基汞發(fā)生快速脫烷基。圖3結(jié)果也顯示去烷基化產(chǎn)生的無機汞是定量的，脫烷基轉(zhuǎn)為無機形態(tài)的汞和甲基汞和無機汞的總和是恒定的。

以前的研究證明，甲基汞存儲在1%鹽酸的聚乙烯容器中不穩(wěn)定但存儲在玻璃的時候較穩(wěn)定[17]。無機汞易吸附在容器壁上以揮發(fā)Hg(0)蒸氣而損失，通過降低溶液的pH值和添加氧化性酸和配位劑穩(wěn)定。甲基汞在無機酸[18]1～5%溶液中較穩(wěn)定，并且加入半胱氨酸[19]，存儲在聚乙烯容器，并存儲在二氯甲烷中[20]。本研究對聚丙烯容器對汞的影響進行測試研究，觀察無機汞和甲基汞的變化情況。

無機汞儲存在1%L-半胱氨酸oHCloH2O的聚丙烯試管內(nèi)一直保持穩(wěn)定。在第二個實驗中減少L-半胱氨酸oHCloH2O的濃度(0.02% w/v)并對聚丙烯試管內(nèi)的甲基汞進行評價。結(jié)果表明1000 μg/L的無機汞和甲基汞單標(biāo)或者混標(biāo)儲存在0.02%L-半胱氨酸oHCloH2O中在96 h內(nèi)可以保持穩(wěn)定。圖1結(jié)果顯示甲基汞在容器內(nèi)隨時間增加而降低，在20 h后下降明顯，60 h后逐漸變緩趨于平衡；無機汞隨時間增長而逐漸增加，和甲基汞呈反比，有明顯的規(guī)律性變化；總汞含量基本保持不變。這一結(jié)果提示在研究中要掌握好檢測的時間節(jié)點，避免試驗中存在的系統(tǒng)誤差。另外，選取棕色玻璃瓶進行標(biāo)準(zhǔn)品儲存可有效避免甲基汞降解。

根據(jù)以上實驗結(jié)果我們在提取過程中務(wù)必當(dāng)天進行測定，提取液保存不超過26小時測定。提取液置于棕色進樣瓶內(nèi)避光保存。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液穩(wěn)定性

干凈玻璃容器(進樣瓶)內(nèi)置1% w/v L-半胱氨酸·HCl·H2O內(nèi)含標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，結(jié)果(圖2)顯示雖然單獨儲存1 μg/L的無機汞比較穩(wěn)定，但相同濃度的甲基汞卻以相同速率脫烷基化。因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)置于避光環(huán)境下作為預(yù)防措施。

3.5 色譜條件的選擇

3.5.1 流動相的選擇

本實驗以0.1%w/v的L-半胱氨酸+ 0.1%w / v的L-半胱氨酸·HCl·H2O為流動相，以不同溶液的體積比(分別為70∶30、50∶50、40∶60)為條件進行測試，當(dāng)體積比為1∶1時，樣品的出峰時間、峰形、靈敏度較適宜，與文獻報道一致。另外，實驗中采用不同流速進行進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)速度在1 mL/min時保留時間及出峰順序良好。

3.5.2 柱溫的選擇

研究中固定其他色譜條件，將色譜柱溫度從20 ℃升至40 ℃，結(jié)果顯示甲基汞保留時間變化不明顯，為有效確保柱效及色譜柱使用壽命，方法采取柱溫為室溫。甲基汞和無機汞的保留時間分別2.560min，無機汞4.830min，從色譜圖可見兩種標(biāo)準(zhǔn)品峰形尖銳，分離良好(圖3)。

3.6 校準(zhǔn)曲線的制備

3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液與標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確吸取一定量甲基汞和無機汞標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)混合液，采用流動相依次稀釋為0.0μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L、10μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用濃度X作為橫坐標(biāo)，峰面積Y作為縱坐標(biāo)，分別繪制無機汞汞和甲基汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表4)。

表4 CH3Hg+和Hg2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限

3.6.2 方法檢出限、精密度和準(zhǔn)確度

采用不含甲基汞和無機汞的中藥材，分別向其中添加2.5 μg/L和10.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用方法1.4進行處理，并重復(fù)進樣6次，計算加標(biāo)回收率和方法精密度，在2.5 μg/L和10.0 μg/L兩組濃度水平想測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%～9.8%，加標(biāo)回收率甲基汞為78.0%～98.8%，無機汞為87.3～94.5%。根據(jù)色譜響應(yīng)值S/N≥3標(biāo)準(zhǔn)計算，甲基汞和無機汞的方法檢出限在為0.007 mg·kg-1和0.005 mg·kg-1。

4 結(jié)論

本研究采用L-半胱氨酸·HCl·H2O進行提取，并采用HPLC-ICP-MS 聯(lián)用技術(shù)對動物源性中藥材中的汞形態(tài)進行分析研究。采用相適應(yīng)的前處理方法，充分優(yōu)化液相色譜和ICP-MS條件，選擇以0.1%w/v的L-半胱氨酸·HCl·H2O為提取試劑，萃取后加熱至60 ℃維持120 min，Reversed phaseC18柱分離汞化合物形態(tài)。采用本方法對動物源性中藥材中的汞形態(tài)進行分析，靈敏度高，甲基汞和無機汞的方法檢出限在為0.007 mg·kg-1和0.005 mg·kg-1，方法驗證工作中采用加標(biāo)回收評價了該方法對動物源性中藥樣品的可靠性，加標(biāo)回收率在78.0 ～98.8%之間，良好的精密度和回收率可保證本方法可以充分滿足常規(guī)分析需要，方法準(zhǔn)確性高、可靠性好，可以為國標(biāo)方法制定及藥品市場監(jiān)管提供良好的參考資料。

[1] US EPA. Mercury Study Report to Congress, Vol. 7: Characterizationof Human Health and Wildlife Risks from Mercury Exposure in theUnited States. 1997.

[2] Anton M S, Michael W M, Mark B S, et al. Effects of environmentalmethylmercury on the health of wild birds,animals andfish[J]. AMBIO, 2007, 36(1): 12-19.

[3] Center for Disease Control and Prevention. National Report on Human Exposure to Environmental Chemicals[C]. Atlanta: National center forenvironmental health, 2006: 45-52.

[4] US EPA. Water Quality Criterion for the Protection of Human Health:Methyl Mercury[M]. US: Environmental Protection Agency, Washington, 2001.

[5] National Research Council(NRC).Toxicological Effects of Methylmercury[M]. National Academy Press, Washington, 2000.

[6] Schober S E, Sinks T H, Jones R L, et al. Blood mercury levelsin US children and women of childbearing age, 1990-2000[J]. Journalof The American Medical Association, 2003, 289(13): 1667-1674.

[7] 吳雅紅,傅曉輝,趙智鋒.對魚體中甲基汞的萃取富集和測定的研究[J].食品科學(xué)，2005, 26( 6): 213～215.

[8] 張麗華,胥學(xué)鵬,史寶成,等.河流底泥中甲基汞、乙基汞的測定[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2005, 21(2): 14-16.

[9] 鄧桂春,高路,張渝陽,等.廢水和底泥中烷基汞的氣相色譜法測定[J].商丘師范學(xué)院學(xué)報,2005,21(5): 106-109.

[10] 孫瑾,陳春英,李玉鋒,等.超聲波輔助溶劑萃取-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定生物樣品中的總汞和甲基汞[J].光譜學(xué)與光譜分析,2007,27(1):173-176.

[11] Holak W. Analyst,1982,107: 1457.

[12] Beauchemin D, Siu K W M, Berman S S. Anal. Chem, 1988,60: 2587.

[13] Wan C C, Chen C S, Jiang S J. J Anal At Spectrom, 1997,12: 683.

[14] Rai R, Maher W, Kirkowa F, J Anal At Spectrom, 2002,12: 1560.

[15] Gill U, Bigras L, Schwartz H. Chemosphere,2004,56:1097.

[16] Ahmed R, Stoeppler M. Decomposition and stability studies of methylmercury in water, in: M. Stoeppler, H.W. D¨urbeck (Eds.), Contributions to Environmental Specimen Banking, KFA J¨ulich, Germany, 1986, p. 19, pp. 21-23, 41.

[17] Yu L P, Yan X P. Trends Anal Chem, 2003,22: 245.

[18] Parker J L, Bloom N S. Sci. Total Environ, 2005,337: 253.

[19] Gaona X, Valiente M. Anal Chim Acta, 2003,480: 219.

[20] Devai I, Delaune R D, Patrick W H Jr, Gambrell R P. Org Geochem, 2001,32:755.

Determination of methylmercury and mercury in animal Chinese herb by HPLC-ICP-MS.

Hang Jing1,2,Feng Xiaoqing3, Hu Xiaoshu1

(1.NanjingMedicalUniversity,Nanjing211166，China;2.HuaianInstituiteforFoodandDrugControl,Huaian223300，China;3.HuaianCenterforDiseaseControlandPrevention,Huaian223001，China)

A method was developed for determination of methylmercury and mercury in the animal Chinese herb. The determination result showed that L-cysteine could make methylmercury stable and to de-alkylated by controling the time and concentration. Polypropylene could affect methylmercury stability.

animal Chinese herb; mercury, methylmercury; HPLC-ICP/MS

杭婧，女，本科，從事食品藥品檢驗工作。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.020

2016-09-17

*通訊作者