馮 娜

(銀川能源學(xué)院，寧夏 銀川 750105)

?

酶協(xié)同微波輔助提取紅棗多糖的工藝優(yōu)化

馮 娜

(銀川能源學(xué)院，寧夏 銀川 750105)

以靈武紅棗為試驗(yàn)材料，采用胰蛋白酶協(xié)同微波輔助提取紅棗中的多糖，研究酶濃度、酶解時(shí)間、料水比、微波功率、微波時(shí)間等因素對(duì)多糖提取得率的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定較優(yōu)提取工藝條件。結(jié)果表明：酶協(xié)同微波輔助提取紅棗多糖的最優(yōu)工藝條件為：胰蛋白酶1.5%，pH 8.0，料水質(zhì)量比1∶20，酶解2.0 h，滅酶后用中火微波提取5 min。

紅棗；多糖；提??；胰蛋白酶；微波

目前關(guān)于多糖特性與功能的研究和開(kāi)發(fā)已成為食品研發(fā)機(jī)構(gòu)、醫(yī)藥行業(yè)研究的焦點(diǎn)。一些免疫試驗(yàn)[1]證明，多糖不僅能激活T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能活化補(bǔ)體，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，具有協(xié)助抗體蛋白扼殺病原微生物的特性或具備配合吞噬細(xì)胞殺滅病原菌的功能。此外，有研究[2]表明，多糖還具有降血糖、降血脂、抗氧化的功效。

紅棗多糖作為紅棗中含量較高的天然活性成分，具有顯著的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的功能和很好的抗補(bǔ)體活性，對(duì)抗氧化、抗衰老、提高機(jī)體免疫力具有重要的促進(jìn)作用[3]。

目前提取多糖的方法主要有熱水浸提法、堿式提取法、超聲波提取法、酶提取法、微波提取法等[4-5]，未見(jiàn)酶協(xié)同微波輔助提取紅棗多糖的報(bào)道。酶—微波結(jié)合提取紅棗多糖的工藝一方面降低了多糖提取工藝中多種化學(xué)試劑的污染，保證了提取工藝的安全性，另一方面也在多糖提取的實(shí)際應(yīng)用中提高了多糖得率[6]，從而進(jìn)一步提高了生產(chǎn)效益。

本試驗(yàn)擬對(duì)提取紅棗多糖的影響因素進(jìn)行研究，并優(yōu)化紅棗多糖的提取工藝，以期為紅棗多糖的深加工提供新的思路，同時(shí)也為提高紅棗產(chǎn)品附加值提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅棗：靈武紅棗，寧夏靈武果業(yè)公司；

胰蛋白酶：酶活≥250 U/mg，上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司；

乙醇、濃硫酸、苯酚、雙氧水：分析純。

1.2 儀器

粉碎機(jī)：AMR128型，中山市東鳳鎮(zhèn)愛(ài)蜜爾電器廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-2型，江蘇電器冷作金廠；

電熱恒溫水浴鍋：H.H.S Ⅱ-6型，上海醫(yī)療器械五廠；

電子天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

離心機(jī)：LXJ-Ⅱ型，上海醫(yī)療器械三廠；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：752P型，上海光譜儀器有限公司；

微波爐：LG WD700(MG-5021T1)型，樂(lè)金電子電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅棗多糖的提取工藝

紅棗→烘干→粉碎→酶解→微波提取→過(guò)濾→醇沉→離心→復(fù)溶→脫色→醇沉→離心→干燥→紅棗粗多糖[7]

1.3.2 操作要點(diǎn)

(1) 預(yù)處理：紅棗在50 ℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

(2) 酶解：準(zhǔn)確稱取一定量棗粉，按料水質(zhì)量比1∶20加入含2.0%的胰蛋白酶的水溶液(pH 8.0)，于37 ℃下酶解2 h。

(3) 微波提?。?00 ℃水浴滅酶10 min后，于微波爐中進(jìn)行中火微波提取4 min，過(guò)濾。

(4) 醇沉：過(guò)濾、濃縮后，加入一定比例的無(wú)水乙醇，于冰箱中靜置過(guò)夜后，以4 000 r/min離心15 min。

(5) 脫色：離心后加水復(fù)溶，加入0.4倍的30%雙氧水，40 ℃水浴4 h，再重復(fù)進(jìn)行上一步驟的醇沉和離心。

(6) 干燥：于60 ℃烘箱中干燥至恒重，即得粗多糖。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

(1) 酶濃度：料水質(zhì)量比1∶20，酶解2 h，微波中火提取3 min，考察酶濃度(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%)對(duì)多糖得率的影響。

(2) 料水比：胰蛋白酶2%，酶解2 h，微波中火提取3 min，考察料水質(zhì)量比(1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30)對(duì)多糖得率的影響。

(3) 酶解時(shí)間：料水質(zhì)量比1∶20，胰蛋白酶2%，微波中火提取3 min，考察酶解時(shí)間(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)對(duì)多糖得率的影響。

(4) 微波功率：料水質(zhì)量比1∶20，胰蛋白酶2%，酶解2 h,微波提取3 min，考察微波功率(溫火、解凍、底火、中火、高火)對(duì)多糖得率的影響。

(5) 微波時(shí)間：料水質(zhì)量比1∶20，胰蛋白酶2%，酶解2 h，微波中火提取，考察微波時(shí)間(2，3，4，5，6 min)對(duì)多糖得率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶濃度、酶解時(shí)間、料水比、微波時(shí)間為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以確定紅棗多糖的最佳提取條件。

1.3.5 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚—硫酸法[8]。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取濃度為0.120 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL于10 mL比色管中，分別加入蒸餾水0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4 mL，5%的苯酚溶液1.0 mL后，再加入濃硫酸5.0 mL，搖勻避光放置30 min，另取10 mL比色管，加水1.0 mL，5%的苯酚溶液1.0 mL，然后加入濃硫酸5.0 mL，按上述方法操作制得空白溶液，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

1.3.7 紅棗粗多糖的測(cè)定 取試驗(yàn)提取的干粗多糖0.010 0 g用蒸餾水定容至100 mL，從中吸取1.0 mL至比色管中，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，再緩慢加入5.0 mL濃硫酸溶液，搖勻避光放置30 min，在490 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.8 多糖得率 按式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用加權(quán)平均法，即將各項(xiàng)指標(biāo)除以該列最大值乘以100為該項(xiàng)得分。權(quán)衡紅棗多糖得率(x)和含量(y) 兩項(xiàng)指標(biāo)，確定二者的權(quán)重系數(shù)均為0.5，對(duì)兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和，通過(guò)公式z=0.5x+0.5y，得到綜合評(píng)分(z)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.6的方法繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，所得到回歸方程為Y=9.562 5x-0.025 25，相關(guān)系數(shù)R=0.992 2。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The A-c standard curve of glucose

2.2 酶濃度對(duì)紅棗多糖提取的影響

由圖2可知，胰蛋白酶濃度較低時(shí)，紅棗多糖的得率和含量隨著酶濃度的升高而快速升高；當(dāng)酶濃度達(dá)到2%時(shí)，得率和含量達(dá)到最大；當(dāng)酶濃度超過(guò)2%時(shí)，其得率和含量基本保持不變。因?yàn)槊笣舛容^低時(shí)，酶對(duì)紅棗游離蛋白質(zhì)的水解作用較弱，不利于多糖的浸出，使紅棗多糖的得率和含量較低。酶濃度較高時(shí)，酶與游離蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)達(dá)到平衡，紅棗細(xì)胞液中和溶液中的多糖也達(dá)到平衡，使多糖的得率和含量基本保持不變[10]。因此紅棗多糖以2%胰蛋白酶提取較適宜。

2.3 料水比對(duì)紅棗多糖提取的影響

由圖3可知，隨著料水質(zhì)量比的增大，多糖的得率和含量逐漸上升；當(dāng)達(dá)到1∶20時(shí)，紅棗多糖的得率和含量達(dá)到最大值；繼續(xù)增加料水比，多糖得率和含量均下降，但其得率下降不明顯。造成多糖得率和含量這種變化的原因主要是由于酶解反應(yīng)需要最佳的底物濃度即料水比。因此，綜合考慮選用料水質(zhì)量比為1∶20。

圖2 酶濃度對(duì)多糖提取的影響Figure 2 The influence of Enzyme concentration on polysaccharide extracting

圖3 料水比對(duì)多糖提取的影響Figure 3 The influence of material ratio on polysaccharide extracting

2.4 酶解時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取的影響

由圖4可知，紅棗多糖的得率和含量隨酶解時(shí)間的增加而提高；當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，多糖的得率和含量達(dá)到最大；隨后繼續(xù)增加酶解時(shí)間，其得率和含量下降。這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間較短時(shí)，酶與底物的接觸不充分，反應(yīng)機(jī)會(huì)減少，因而多糖的得率和含量較低；若酶解時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，胰蛋白酶的水解能力達(dá)到飽和，紅棗細(xì)胞液中的其他物質(zhì)就會(huì)與酶作用生成雜質(zhì)，多糖結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化或降解，并且有些非多糖物質(zhì)會(huì)溶于溶劑中[10-11]，影響多糖的得率和含量。因此，酶解時(shí)間并非越長(zhǎng)越好，選用酶解時(shí)間為2 h最好。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取的影響Figure 4 The influence of enzymatic hydrolysis time on polysaccharide extracting

2.5 微波功率對(duì)紅棗多糖提取的影響

由圖5可知，紅棗多糖的得率隨微波功率的增加呈直線上升趨勢(shì)；多糖的含量隨微波功率的增加上升，到中火時(shí)達(dá)到最大，但微波功率為高火時(shí)卻下降。這表明微波功率對(duì)多糖得率和含量的影響不如其他因素明顯?？紤]到微波功率過(guò)高容易造成容器內(nèi)液體劇烈沸騰，沸騰的液體會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，快速噴出提取容器，造成有效成分損失[12]。綜合考慮，選用微波中火提取多糖能保證得率高含量也高。

2.6 微波時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取的影響

由圖6可知，微波提取時(shí)間的長(zhǎng)短變化可明顯改變多糖的得率和含量。起初隨著微波時(shí)間的增加，得率和含量增加；當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到4 min時(shí)，其得率和含量達(dá)到最大值；隨著微波時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，得率和含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因?yàn)槲⒉〞r(shí)間過(guò)短時(shí)，微波不能充分提高棗粉內(nèi)部的溫度和壓力。微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)降低某些反應(yīng)的活化能，從而促使多糖分子與其它分子之間形成新的化學(xué)鍵，增加分子之間的作用力，阻止多糖分子浸入溶液[13]。因此，確定提取紅棗多糖的最佳微波時(shí)間為4 min。

圖5 微波功率對(duì)多糖提取的影響Figure 5 The influence of microwave power on polysaccharide extracting

圖6 微波時(shí)間對(duì)多糖提取的影響Figure 6 The influence of microwave time on polysaccharide extracting

2.7 提取紅棗多糖的正交試驗(yàn)

由于單因素試驗(yàn)表明微波功率對(duì)紅棗多糖的得率和含量影響不大，因此進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)只選取酶濃度、酶解時(shí)間、料水比、微波時(shí)間為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以紅棗多糖的得率和含量為考核指標(biāo)，并用加權(quán)平均法進(jìn)行綜合評(píng)分，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以確定最佳的提取條件。其因素水平、試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2。

由表2可知，各因素對(duì)紅棗多糖提取的影響次序?yàn)椋築>C>D>A，即酶解時(shí)間對(duì)紅棗中多糖提取的影響最大，料水比次之，微波時(shí)間和酶濃度對(duì)其影響程度不明顯。最佳提取

表1 因素水平表Table 1 Factors level table

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

條件為B2C2D3A1，即酶解時(shí)間為2.0 h，料水質(zhì)量比為1∶20，微波時(shí)間為5 min，胰蛋白酶濃度為1.5%。

由于該條件組合不在正交試驗(yàn)中, 故需做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果為：在該組合條件下紅棗多糖得率和含量為 10.97%，63.48%，綜合得分102，平行實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性好。因此，紅棗多糖最佳提取條件為胰蛋白酶濃度1.5%，酶解時(shí)間2 h，料水質(zhì)量比1∶20，微波時(shí)間5 min。

3 結(jié)論

本研究采用胰蛋白酶協(xié)同微波輔助提取紅棗中的多糖，確定了紅棗多糖提取的最優(yōu)條件，用1.5%的胰蛋白酶(pH 8.0)，以料水質(zhì)量比1∶20于37 ℃酶解2.0 h，中火微波提取5 min，紅棗多糖得率為 10.97%。但提取的粗多糖中多糖含量為63.48%，仍含有較多雜質(zhì)，可以通過(guò)層析法等方式對(duì)其進(jìn)行純化，以提高紅棗多糖純度。

[1] 呂磊. 大棗多糖的提取分離與脫色研究[D]. 西安: 西北大學(xué), 2003: 1-12.

[2] 石奇, 樊君, 石異, 等. 中性蛋白復(fù)合酶法提取大棗多糖的研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2009, 20(1): 7-8.

[3] 林勤保, 高大維, 于淑娟, 等. 大棗多糖的分離和純化[J]. 食品工業(yè)科技, 1998(4): 20-21.

[4] 李環(huán)宇, 王敏, 李五霞, 等. 超聲波輔助酸性緩沖液浸提木棗多糖的工藝優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2015, 31(3): 179-182.

[5] 方元, 許銘強(qiáng), 汪欣蓓, 等. 超聲波輔助提取哈密大棗多糖的工藝優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2014, 30(2): 175-180.

[6] 亓樹(shù)艷, 王荔, 莫曉燕. 大棗多糖的提取工藝及抗氧化作用研究[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(4): 117-120.

[7] 林勤保. 大棗多糖的分離和純化[J].食品工業(yè)科技, 1998(4): 20-21.

[8] 李雪華, 龍盛京. 大棗多糖的提取與抗活性氧研究[J]. 廣西科學(xué), 2000, 7(1): 54-56.

[9] 楊云, 馮衛(wèi)生, 孟江, 等. 正交試驗(yàn)法優(yōu)選大棗渣多糖水煎煮提取工藝[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2003, 14(3): 200-202.

[10] 楊云. 酶法提取大棗多糖的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2003, 24(10): 93-94.

[11] 林勤保. 大棗多糖的單糖組成的高效液相色譜法研究[J]. 鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào),1998, 19(3): 57-60.

[12] 楊世平, 孫潤(rùn)廣. 陜北紅棗中多糖的酶加水法提取工藝研究[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2005, 23(4): 373-375.

[13] 劉依, 韓魯佳. 微波技術(shù)在板藍(lán)根多糖提取中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 7(2): 27-30.

Procedure optimization on extraction of jujube polysaccharide with enzyme-microwave張麗芝ZHANG Li-zhi

FENGNa

(TheCollegeofEnergyResourcesofYinChuan,Yinchuan,Ningxia750105，China)

The polysaccharide from Lingwu Jujube was extracted using enzyme-microwave method. Moreover, the influence factors of polysaccharide extraction were studied, i.e. the enzyme concentr-ation, the hydrolysis time, the material ratio, the microwave power, and the treatment time, and then the optimum extraction condition were finally determined through orthogonal test. The results showed that the jujube polysaccharide could be extracted with high efficiency by combining the utilization of 1.5% trypsin (pH 8.0, hydrolyzing for 2.0 h) with the microwave (under the medium fire for 5 min), controlling the material ratio at 1∶20 (mass ratio).

red date; polysaccharide; extraction; trypsin; microwave

張麗芝(1983—)，女，銀川能源學(xué)院講師，在職碩士。 E-mail:zlz1201@163.com

2016—08—30

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.033