隋春光

梁金鐘

王風(fēng)青

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076)

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植物乳桿菌Lp-S2直投式發(fā)酵劑及其離心、冷凍干燥工藝研究

隋春光

梁金鐘

王風(fēng)青

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076)

以高產(chǎn)γ-氨基丁酸的植物乳桿菌Lp-S2為出發(fā)菌株，研制直投式發(fā)酵劑。并對(duì)發(fā)酵劑離心工藝及冷凍干燥工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)正交試驗(yàn)確定植物乳桿菌Lp-S2 的離心工藝為：離心溫度4 ℃，離心時(shí)間30 min，轉(zhuǎn)速6 000 r/min，該條件下植物乳桿菌Lp-S2離心收得率為83.8%。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)進(jìn)行冷凍保護(hù)劑的優(yōu)化。冷凍保護(hù)劑的最佳組合是15%海藻糖，15%葡萄糖和10%脫脂乳粉。植物乳桿菌Lp-S2直投式發(fā)酵劑，凍干存活率為39.2%，最佳預(yù)冷時(shí)間為6 h。直投式發(fā)酵劑活菌數(shù)達(dá)到1.5×1012CFU/mL。

直投式菌劑；植物乳桿菌；冷凍干燥；γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸(GABA)，是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在動(dòng)物體內(nèi)，GABA是一種非常重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。對(duì)人體有鎮(zhèn)靜安神、降低血壓、改善腦機(jī)能和調(diào)節(jié)激素分泌等重要作用[1]。植物乳桿菌Lp-S2是本實(shí)驗(yàn)室自主分離并保藏的菌株，具有發(fā)酵底物高產(chǎn)GABA的能力。由于該菌株具有這些特點(diǎn)，將其制備成直投式發(fā)酵劑，應(yīng)用于發(fā)酵食品的制作具有重要的意義。

目前直投式發(fā)酵劑(directed vat set，DVS)的研究，主要集中在通過(guò)高密培養(yǎng)，提高凍干前菌體數(shù)量方面。通過(guò)篩選及優(yōu)化乳酸菌增殖培養(yǎng)基，優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵條件，通過(guò)細(xì)菌菌體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)技術(shù)，運(yùn)用新型發(fā)酵技術(shù)，營(yíng)養(yǎng)與代謝基礎(chǔ)上，恒定pH發(fā)酵、進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵等，達(dá)到高密度培養(yǎng)的目的[2-4]。乳酸菌高密度培養(yǎng)是制備直投式發(fā)酵劑的前提，通過(guò)高密度培養(yǎng)發(fā)酵得到大量的活性乳酸菌，然后將培養(yǎng)液中的菌體進(jìn)行濃縮收集。由于離心收集法具有不易污染，設(shè)備及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)踐中被廣泛應(yīng)用。在離心的工藝中，會(huì)產(chǎn)生機(jī)械力及摩擦產(chǎn)生的高溫，會(huì)對(duì)菌體造成損傷。另外，菌體在離心時(shí)會(huì)有少量的菌體殘留在上清液中。因此選擇合適的離心工藝參數(shù)，獲得理想的離心收得率是非常重要的。同時(shí)如何保證凍干后菌體的存活率也是直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)的關(guān)鍵。在冷凍干燥過(guò)程中，菌體細(xì)胞受到冷凍及真空干燥兩種物理過(guò)程，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，造成凍干后活菌數(shù)降低。如何將凍干工藝的傷害降低到較低的水平，盡可能保持菌體的生理活性及功能，這都是需要解決的問(wèn)題。除了選擇菌體活菌數(shù)較多，活力較強(qiáng)的時(shí)間進(jìn)行冷凍干燥外，加入凍干保護(hù)劑是較有效的解決方法。由于細(xì)胞大小和結(jié)構(gòu)的差異，采用相同的保護(hù)劑所得到的保護(hù)效果也有差異，同時(shí)保護(hù)劑對(duì)微生物保護(hù)作用具有選擇性，這些都需要通過(guò)試驗(yàn)來(lái)最終確定。由于凍干保護(hù)劑的研究一般屬于專利資料，同時(shí)研究報(bào)告[5-6]的結(jié)果一般存在很大差異。因此對(duì)直投式發(fā)酵劑的離心及冷凍干燥工藝進(jìn)行研究，具有重要意義。

目前，對(duì)于GABA產(chǎn)生菌的研究[7-8]主要集中在優(yōu)化發(fā)酵條件提高GABA的產(chǎn)量，還未有學(xué)者研究高產(chǎn)GABA的植物乳桿菌直投式發(fā)酵劑。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)植物乳桿菌LP-S2高密度培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)菌體大量增殖，通過(guò)優(yōu)化離心工藝，對(duì)凍干保護(hù)劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化，對(duì)預(yù)冷時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，最終制成具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力的乳酸菌直投式發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

植物乳桿菌Lp-S2：本試驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基(MRS)：葡萄糖20 g、酵母膏5 g、牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、KH2PO42 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、吐溫80 1 mL、加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉等：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)：分析純，西安百川生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：DNP-160型，上海一恒科技有限公司；

超凈工作臺(tái)：YJ-875型，蘇州順鑫凈化科技有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDXZ-50KB型，上海申安醫(yī)療器械廠；

離心機(jī)：LG10-2.4A型，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；

超低溫冰箱：DW-FW351型，中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FD5-3型，美國(guó)西盟國(guó)際公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定 采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取1 mL菌液以加入到9 mL滅菌的生理鹽水中，依次遞增稀釋，選擇10-8，10-9，10-103個(gè)稀釋度。取1 mL稀釋液于無(wú)菌的空培養(yǎng)皿中，倒入15 mL溶化并冷卻至45 ℃的MRS培養(yǎng)基，放置于操作臺(tái)上混勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣，凝固后37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，選擇25～200個(gè)菌數(shù)的平板進(jìn)行讀數(shù)，然后乘以稀釋倍數(shù)[9]。

1.2.2 植物乳桿菌高密度菌懸液的制備 將MRS培養(yǎng)基，分裝至10個(gè)250 mL的三角瓶中，裝液量150 mL，于121 ℃滅菌20 min。在超凈工作臺(tái)接種2%的種子發(fā)酵劑，恒溫37 ℃培養(yǎng)15 h制取菌懸液。

1.2.3 高密度菌懸液離心條件的研究 將得到的高密度菌懸液進(jìn)行離心，在文獻(xiàn)[10]的基礎(chǔ)上，選擇不同的離心溫度、離心時(shí)間、離心機(jī)轉(zhuǎn)速進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，因素和水平組合表見(jiàn)表1。

分別記錄離心前后活菌數(shù)，按式(1)計(jì)算樣品的離心收得率。將離心收得率做為衡量離心試驗(yàn)效果的指標(biāo)。

表1 L9(33)因素和水平組合表Table 1 Factor and level of L9(33) test

(1)

式中：

c——離心收得率，%；

m——沉淀中活菌數(shù)，CFU/mL；

n——離心前活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4 凍干保護(hù)劑優(yōu)化的研究 冷凍干燥過(guò)程一般工藝流程為：

高密度培養(yǎng)液→離心→菌泥→添加凍干保護(hù)劑→菌懸液→預(yù)冷→預(yù)凍→真空冷凍干燥→收集菌粉

將高密度培養(yǎng)液進(jìn)行離心，倒掉上清液，將剩下的菌泥倒于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，菌泥與保護(hù)劑按1∶3體積比混勻，平衡30 min，制得菌懸液。用保鮮膜封好并扎口，將配置好的菌懸液在4 ℃進(jìn)行預(yù)冷0～12 h進(jìn)行成型，在-70 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍14 h后置于真空冷凍干燥設(shè)備中，在真空度為3～5 Pa條件下冷凍干燥48 h左右得到凍干菌粉[11]。

選取海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糊精、γ-PGA、脫脂乳粉、谷氨酸鈉作為單一凍干保護(hù)劑，通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]確定單一保護(hù)劑的濃度，分別測(cè)得凍干前后的活菌數(shù)并計(jì)算凍干菌體存活率。通過(guò)篩選得到較優(yōu)的3種凍干保護(hù)劑進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳的復(fù)合保護(hù)劑組合配方。冷凍干燥后菌體存活率按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

a——菌體存活率，%；

m1——凍干后總活菌數(shù)，CFU/mL；

m2——凍干前總活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5 預(yù)冷時(shí)間的優(yōu)化 預(yù)冷是在-70 ℃預(yù)凍之前，將菌懸液溫度降至4 ℃，并保溫一段時(shí)間。預(yù)冷能夠很好地提高乳酸菌的凍干存活率。一方面能將菌懸液各個(gè)位置的液體均勻地降到較低溫度，同時(shí)不形成冰晶。在下一步預(yù)凍工藝中能縮短菌懸液渡過(guò)最大冰晶生成帶的時(shí)間，減少大的冰晶形成，從而提高細(xì)菌的存活率。另一方面4 ℃預(yù)冷給細(xì)胞一個(gè)低溫適應(yīng)過(guò)程，促使細(xì)胞做出適應(yīng)低溫環(huán)境的一些生化變化，例如某些與抗凍相關(guān)蛋白的形成。試驗(yàn)時(shí)，使用優(yōu)化后的復(fù)合保護(hù)劑配方制備菌懸液，然后分別預(yù)冷0，2，4，6，8，10，12 h后，采用相同的工藝進(jìn)行冷凍干燥操作，測(cè)量每個(gè)樣品凍干存活率，確定最佳預(yù)冷時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 離心條件試驗(yàn)結(jié)果

在離心工藝中，影響菌體存活率主要有兩個(gè)方面因素：① 由于離心力作用產(chǎn)生的摩擦溫度及機(jī)械剪切作用因素，造成菌體死亡；② 離心工藝不可能把所有的菌體都離心到離心管底部，有少量菌體殘留在上清液中造成菌體損失。如果離心參數(shù)控制不當(dāng)，菌體損失率和死亡率增高，必然造成菌體收得率降低，最終直接導(dǎo)致活菌數(shù)量降低，影響發(fā)酵劑的產(chǎn)品質(zhì)量[13]。選擇不同的離心溫度、離心時(shí)間、離心機(jī)轉(zhuǎn)速進(jìn)行正交試驗(yàn)。

以離心收得率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)獲得的正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表2。由表2可知，對(duì)植物乳桿菌Lp-S2離心工藝影響大小的順序是離心溫度>離心時(shí)間>離心機(jī)轉(zhuǎn)速。最佳組合是A1B3C2，即離心溫度為4 ℃，離心時(shí)間為30 min，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min時(shí)離心效果最佳。該條件下，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。植物乳桿菌Lp-S2離心收得率平均達(dá)到83.8%。說(shuō)明正交試驗(yàn)效果較好。

表2 離心正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Results of centrifugal orthogonal experiment

2.2 凍干保護(hù)劑優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 保護(hù)劑單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)選擇不同種類的保護(hù)劑溶液進(jìn)行單因素測(cè)試。保護(hù)劑的種類和添加量見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，加入單一保護(hù)劑對(duì)菌體在凍干過(guò)程中的保護(hù)作用差異十分明顯，凍干存活率從不加保護(hù)劑的0.16%提高到16.2%。在植物乳桿菌凍干工藝中，海藻糖是較優(yōu)的凍干保護(hù)劑，其次是葡萄糖和脫脂乳粉。

表3 單一保護(hù)劑對(duì)存活率的影響Table 3 Effect of single protectant on survival rate %

2.2.2 復(fù)合保護(hù)劑正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取凍干效果較好的海藻糖、葡萄糖和脫脂奶粉作為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。復(fù)合保護(hù)劑因素水平表見(jiàn)表4。

表4 復(fù)合保護(hù)劑因素水平表Table 4 Compound protectant factor level table %

由表5可知，由海藻糖、脫脂奶粉和葡萄糖組成的混合保護(hù)劑對(duì)菌體的保護(hù)作用明顯強(qiáng)于單一成分的保護(hù)劑。所有組合的菌體存活率均大于單一因素測(cè)試中最高的16.2%，其中混合配方中最高的組合達(dá)到38.6%。直觀分析可知：海藻糖對(duì)復(fù)合保護(hù)劑效用的影響最大，葡萄糖也有顯著影響，脫脂奶粉影響最小。最佳的保護(hù)劑組合配方為A3B2C3，即海藻糖15%、脫脂乳粉10%、葡萄糖15%。進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，按此配比制備菌懸液然后凍干，顯示植物乳桿菌Lp-S2的凍干存活率平均為39.2%，高于正交試驗(yàn)中得到的結(jié)果，正交試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果有效。

復(fù)合保護(hù)劑提高菌體存活率的原因主要是由不同種類的保護(hù)劑通過(guò)不同的方式保護(hù)菌體，復(fù)合保護(hù)后達(dá)到組合保護(hù)的效果。海藻糖、葡萄糖等低分子糖通過(guò)維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，達(dá)到抑制膜內(nèi)結(jié)合水形成冰晶，減少細(xì)胞體的破壞。脫脂乳粉的蛋白是大分子物質(zhì)，可以減少乳酸菌細(xì)胞暴露于介質(zhì)和空氣的面積，并在乳酸菌細(xì)胞表面形成保護(hù)層，防止因細(xì)胞壁破碎而導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，從而起到保護(hù)作用[14-15]。當(dāng)共同使用3種保護(hù)劑時(shí)，菌體存活率明顯增大說(shuō)明三者復(fù)配具有協(xié)同累加效應(yīng)。

表5 保護(hù)劑正交試驗(yàn)結(jié)果分析表Table 5 Results of freeze-dried protectants orthogonal experiment

2.3 預(yù)冷時(shí)間的確定

由圖1可知，預(yù)冷能有效提高菌體的凍干存活率。當(dāng)預(yù)凍時(shí)間在2～6 h，菌體凍干存活率差異顯著(P<0.05)，菌體存活率隨預(yù)凍時(shí)間延長(zhǎng)而增加。可能是通過(guò)將菌懸液的溫度均勻地降低到較低溫度，促進(jìn)菌體的低溫適應(yīng)性和應(yīng)激反應(yīng)，從而提高了菌體的凍干存活率[16-17]。在6 h以后，菌體凍干存活率差異不顯著(P>0.05)，菌體凍干存活率不再明顯增加，可能是與提高凍干存活率相關(guān)的低溫適應(yīng)性生化反應(yīng)基本完成有關(guān)[18]。試驗(yàn)得出，預(yù)冷能有效提高菌體的凍干存活率，最佳預(yù)凍時(shí)間為6 h。

利用優(yōu)化后的離心和冷凍干燥生產(chǎn)的植物乳桿菌Lp-S2直投式發(fā)酵劑，其活菌數(shù)達(dá)到1.5×1012CFU/mL。達(dá)到商品發(fā)酵劑的要求，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

同一小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖1 預(yù)冷對(duì)存活率的影響Figure 1 Effect of pre-cooling onthe survival rate

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了植物乳桿菌Lp-S2 的最優(yōu)離心工藝為：離心溫度4 ℃，離心時(shí)間30 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速6 000 r/min。該條件下植物乳桿菌Lp-S2離心收得率達(dá)到83.8%。通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)合保護(hù)劑進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)的復(fù)合保護(hù)劑配方：海藻糖15%、脫脂乳粉10%、葡萄糖15%。植物乳桿菌Lp-S2添加該復(fù)合保護(hù)劑后，凍干存活率達(dá)到39.2%。通過(guò)對(duì)預(yù)凍時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得到最佳預(yù)冷時(shí)間為6 h。優(yōu)化后離心及冷凍干燥工藝得到的Lp-S2直投式發(fā)酵劑活菌數(shù)達(dá)到1.5×1012CFU/mL。符合商品發(fā)酵劑的要求。同時(shí)該發(fā)酵劑具有發(fā)酵底物高產(chǎn)GABA的效果，因此產(chǎn)品具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。下一步將對(duì)直投式發(fā)酵劑保藏過(guò)程相關(guān)參數(shù)進(jìn)行探索，最終得到植物乳桿菌Lp-S2直投式發(fā)酵劑更完整的制備工藝。

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Study on centrifugal and freeze drying of Lactobacillus plantarum Lp-S2 DVS

SUI Chun-guang

LIANGJin-zhong

WANGFeng-qing

(HarbinUniversityofCommerce,Harbin,Heilongjiang150076,China)

LactobacillusplantarumLp-S2 which has the ability to produce gamma-aminobutyric acid, was used as starting strain to develop Direct vat set(DVS). Then the centrifugation process and freeze-drying process were optimized. By orthogonal experiment the optimal conditions of centrifugation were identified as: centrifugal temperature 4 ℃, Time-consuming 30 minutes, centrifugal force 6 000 r/min. In this condition, the centrifugal recovery rate ofLactobacillusLp-S2 is 83.8%. The cryoprotectant was optimized by single factor and orthogonal test. The best combination of cryoprotectants was 15% trehalose, 15% glucose and 10% skim milk powder. The survival rate ofL.plantarumLp-S2 Direct Vat Set reached 39.2%. The optimum pre-cooling time was 6 h. The number of viable cells of the direct-acting starter was 1.5×1012CFU/mL.

directed vat set;Lactobacillusplantarum; freeze drying;γ-amino butyric acid

黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2010td04)

隋春光，男，黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院講師，博士在讀。

梁金鐘(1957—)，男，哈爾濱商業(yè)大學(xué)教授。 E-mail：Ljz2050@126.com

2016—09—03

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.040